成骨微环境决定乳腺癌细胞在骨髓中的命运
骨是转移性乳腺癌细胞最常见的转移部位。癌细胞播散至骨骼后，可能积极定植形成转移灶，也可能进入休眠状态，这取决于其与骨微环境的相互作用。本研究揭示了成骨微环境如何决定播散至骨髓的癌细胞的命运。
RUNX2促进基底样乳腺癌细胞在稳态骨微环境中的富集
在稳态（非活性）骨微环境中，RUNX2过表达的MDA-MB-231（MDA231）细胞和4T1细胞形成更多、更大的微转移灶，这些微转移灶增殖能力有限（KI67低表达）。而在成骨性预转移灶（PMN）中，RUNX2过表达细胞则形成显著的骨溶解性病变。这表明RUNX2促进了基底样乳腺癌细胞在成年小鼠稳态骨微环境中以休眠微转移灶的形式富集，并在支持性的成骨微环境中促进其进展为明显转移灶和骨溶解性病变。
未矿化的成骨微环境促进基底样RUNX2-OE乳腺癌细胞的骨定植
通过不同持续时间（0、5、10、15、20天）的甲状旁腺激素（PTH）处理，可在小鼠体内建立处于不同分化阶段的成骨微环境。根据骨形态计量学指标，可将PTH诱导的成骨微环境分为三个阶段：类骨质形成期（0-10天，以成骨细胞增多、类骨质积累为特征）、微观矿化期（10-20天，出现钙结节、矿化率增加）和CT可见矿化期（20天后，骨量显著增加）。
将MDA231 RUNX2-OE细胞接种至经不同时间PTH处理的小鼠体内，发现经PTH处理10天（处于类骨质形成期）的小鼠，其多器官（骨、肺、淋巴结）定植发生率显著增加，骨溶解性病变的发生率（75.0%）也显著高于对照组（28.6%）。此阶段破骨细胞尚未激活，骨溶解性病变的增加归因于肿瘤细胞在未矿化成骨微环境中的定植。
异常活化的成骨微环境再激活休眠的基底样癌细胞
对已形成休眠微转移灶的小鼠施用PTH（10天）或低剂量雌二醇（E2，0.3 mg/kg）以诱导异常活化的未矿化成骨微环境，可导致休眠的MDA231 RUNX2-OE细胞再激活，并全部（100%）或绝大多数（87.5%）发展为骨溶解性病变。而高剂量E2（2 mg/kg）诱导的高矿化微环境则未显著增加骨病变的发生率或大小。这表明围绝经期雌激素波动可能触发未矿化的成骨微环境，导致休眠肿瘤细胞再激活并促进骨转移。
RUNX2在高E2支持的高矿化骨微环境中促进管腔样乳腺癌细胞的骨定植
管腔样MCF7细胞需要雌激素支持才能在小鼠体内生长。在E2诱导的高矿化骨微环境中，RUNX2过表达的MCF7细胞骨定植发生率高达85.7%，而对照组细胞仅为34.8%。由于E2导致骨密度增高，MCF7 RUNX2-OE细胞形成的骨病变表现为向外生长，但显微CT清晰显示骨内的溶骨性病变，并伴有破骨细胞高度激活。这凸显了RUNX2-OE管腔样细胞与高矿化活性成骨微环境之间的强协同作用。
未矿化成骨微环境加剧管腔样乳腺癌细胞引起的骨溶解病变
在E2治疗基础上，联合低钙饮食或地塞米松（DEX）以抑制成骨和矿化，可分别诱导产生类骨质积累（低钙饮食）或成骨细胞分化受抑制（DEX）的微环境。在此环境下，MCF7 RUNX2-OE细胞骨定植发生率依然很高，而对照组MCF7细胞的骨定植仅在中度增加。值得注意的是，低钙饮食诱导的未矿化类骨质积累显著加剧了由MCF7细胞（无论是否过表达RUNX2）引起的骨病变，并伴有强烈的破骨细胞激活。这表明未矿化成骨微环境（以类骨质积累为特征）促进了由管腔样癌细胞驱动的破骨性病变的扩展。
破骨细胞可被肿瘤细胞和分化良好的成骨细胞激活
体外共培养实验表明，MDA231和MCF7乳腺癌细胞均能激活小鼠破骨细胞（mOC）祖细胞。虽然前成骨细胞MC3T3-E1本身不触发破骨细胞活化，但经成骨培养基或PTH诱导良好分化的MC3T3-E1细胞则能显著激活破骨细胞。这揭示了在成骨微环境中定植的乳腺癌细胞如何激活破骨细胞，从而促进溶骨性病变的形成。
不同分化阶段成骨微环境中的成骨细胞和骨基质对癌细胞的趋化和增殖具有差异化影响
体外诱导小鼠原代成骨细胞（mOBs）至不同分化状态（骨基质期0-6天、早期矿化期4-10天、矿化期10天后）后发现，经6-8天成骨诱导的成熟成骨细胞对基底样MDA231 RUNX2-OE细胞的趋化作用最强。而未矿化的骨基质（诱导2-4天）能显著促进癌细胞增殖，矿化骨基质则抑制增殖。管腔样MCF7 RUNX2-OE细胞同样被分化良好的成骨细胞（诱导4-8天）强烈招募，并且在成骨细胞支持下，即使在矿化过程中也保持增殖优势。这表明在早期矿化阶段，成熟成骨细胞吸引癌细胞，而未矿化基质支持其增殖，矿化基质则不利于增殖，可能导致骨髓中的休眠微转移。
细胞连接和细胞-基质粘附 underlie 管腔样和基底样癌细胞与成骨微环境的差异化相互作用
转录组分析显示，与细胞-基质粘附相关的基因在基底样MDA231来源的癌细胞中富集，而与细胞连接相关的分子在管腔样MCF7来源的癌细胞中富集更显著，提示管腔样癌细胞与成骨细胞存在密切相互作用。RUNX2过表达改变了细胞周期、粘附、迁移、凋亡等相关基因的表达，增强了癌细胞的“骨拟态”表型，使其对骨髓缺氧反应更强，并激活NF-κB通路、抑制干扰素反应，从而促进骨定植和破骨细胞激活。
阻断乳腺癌细胞与骨基质的相互作用可减少骨定植
考虑到未矿化骨基质支持癌细胞增殖，以及ITGA5介导肿瘤细胞与骨基质的相互作用，使用ITGA5拮抗剂ATN-161进行处理。结果显示，ATN-161降低了经PTH再激活的基底样MDA231 RUNX2-OE癌细胞以及E2支持下的管腔样MCF7 RUNX2-OE癌细胞的骨定植发生率。这表明靶向肿瘤细胞与骨基质的相互作用是防止休眠癌细胞再激活和后续骨定植的一种有前景的策略。
讨论与展望
本研究明确了成骨微环境的分化状态是决定播散性乳腺癌细胞命运的关键。稳态（非活性）微环境促使癌细胞休眠；活跃非矿化微环境支持癌细胞定植和再激活；高矿化微环境对基底样和管腔样癌细胞影响不同，后者更能存活定植。成骨细胞主要负责招募癌细胞，而未矿化骨基质则提供支持增殖的微环境。靶向ITGA5介导的相互作用有望预防骨转移。监测骨转换标志物（如P1NP）和针对整合素信号通路可能为防治乳腺癌骨转移提供新策略。
