文章内容归纳总结
摘要
缺血性心血管疾病，尤其是心肌梗死（MI），是全球范围内发病和死亡的主要原因。通过饮食靶向肠道微生物群的胞外囊泡（EVs）可能为改善心血管健康提供机会。大麦叶（BL）在中医药中历史悠久，并已被发现有益地影响肠道微生物组成。本研究使用小鼠MI模型，探讨了肠道细菌衍生EVs在BL心脏保护作用中的机制。膳食补充BL显著改善了实验性MI后的心脏功能并减轻了不良重塑。BL的心脏保护作用与增强肠道上皮屏障、抑制细菌来源的脂多糖（LPS）易位有关。此外，BL缓解了MI诱导的肠道菌群失调，并富集了毛螺菌科（Lachnospiraceae）。抗生素处理耗竭肠道菌群后，BL的心脏保护作用被取消。更重要的是，移植来自BL喂养小鼠的菌群给受体小鼠，能使其在MI后获得更好的心脏结局。研究鉴定出BL增加了毛螺菌科家族中一个共生成员——Lachnospiraceae_NK4A136_group的丰度。向抗生素处理的小鼠补充活的（而非热灭活的）毛螺菌科，可改善MI小鼠的心肌损伤和心脏重塑。研究人员从毛螺菌科中分离出EVs，并证明毛螺菌科来源的EVs（L-EVs）在口服后具有良好的生物安全性、稳定性和结肠滞留效应。机制上，L-EVs中的雌激素样代谢物通过调控雌激素受体α（ERα）-溶质载体家族6成员14（Slc6a14）-Hippo信号通路，促进肠干细胞功能，最终保护心肌免受MI诱导的不良重塑。因此，本研究为理解微生物群-肠道-心脏轴在MI病理生理学中的作用提供了新见解，并强调了肠道细菌衍生EVs通过改善肠道健康来减少MI后病理结局的巨大潜力。
1 引言
心血管疾病（CVDs）是一组损害心脏和血管的疾病，是全球主要的公共卫生问题，发病率和死亡率很高。心肌梗死（MI）是缺血性心脏病/冠状动脉疾病的常见表现，也是所有CVDs中的主要死亡原因。MI可因动脉斑块形成导致流向心脏的血流减少、损伤心肌细胞，并伴随梗死区域炎症反应和瘢痕形成启动。由于缺氧，心肌细胞发生不良的结构和功能重塑，导致心脏功能受损。尽管MI的临床管理有所改善，但梗死后的心脏重塑和心力衰竭仍然造成相当大的医疗成本和社会负担。因此，开发新的有效方法来减少MI后的心脏不良结局仍然迫切所需。
MI的病理生理学是多因素的，并受遗传和环境因素之间复杂相互作用的影响。目前公认肠道菌群在CVDs（包括MI）的发病机制中起着关键作用。早期研究表明，肠道微生物组的改变和肠道菌群衍生的代谢物与大鼠MI的严重程度有关。与健康对照组相比，MI患者的全身微生物组显示出更高的微生物丰富度和多样性。此外，在MI患者中观察到肠道菌群与代谢物的独特特征。机制上，MI后肠道上皮屏障被破坏，导致通透性增加，菌群衍生的内毒素LPS进入体循环，激活免疫炎症系统，增加心血管事件风险。然而，通过抗生素消除肠道细菌易位可有效缓解MI后的心血管结局。此外，耗竭短链脂肪酸产生菌已被证明会损害MI后的心肌修复。这些研究表明，肠道菌群可能是预防和治疗CVDs的关键靶点。
口服益生菌已被报道可减轻MI后的心肌肥大、心力衰竭和抑郁样行为。然而，使用活细菌可能导致潜在风险，例如抗生素耐药性和在易感人群中引发全身感染。最近，新出现的证据强调了细菌胞外囊泡（EVs）作为活细菌的安全替代品用于疾病干预的巨大潜力。通过将多种生物活性分子包裹在膜结合颗粒中，细菌分泌的EVs成为微生物与其宿主之间跨界交流的关键介质。然而，肠道细菌衍生EVs影响MI发病机制的机制，特别是它们在微生物群-肠道-心脏轴中的作用仍知之甚少。更深入地理解这些机制可能为减轻MI后不良事件开辟新途径。
不良饮食习惯占全球所有CVD死亡人数的52%。近期研究集中于饮食依赖的肠道菌群EVs对宿主健康的影响。理解饮食、肠道菌群和CVDs（如MI）之间的相互作用对于制定有效策略以预防心脏代谢功能障碍至关重要。大麦叶（BL）是大麦的幼草，历史上被记载为具有潜在营养价值的中草药成分。动物和人类研究揭示了其多种健康促进特性，如抗氧化、抗抑郁、降血脂和神经保护活性。我们最近的研究表明，BL可防止结肠炎诱导的肠道菌群失调。然而，BL是否能改善MI后心脏功能并减轻不良重塑，以及这种效应是否与调节肠道菌群有关，仍然未知。
在本研究中，我们提供了证据表明膳食补充BL可以保护心脏免受缺血性损伤，并防止MI诱导的肠道屏障功能障碍和菌群失调。通过抗生素处理和粪便微生物群移植（FMT），我们证明肠道菌群在BL的心脏保护作用中起着重要作用。我们鉴定出BL显著富集了一种共生肠道物种毛螺菌科（Lachnospiraceae），它可以改善肠道屏障功能，预防低度内毒素血症，并最终改善心肌损伤和心脏功能。我们发现毛螺菌科对肠道健康和MI的有益作用很大程度上归因于其分泌的纳米级EVs。机制上，毛螺菌科释放的EVs可通过激活雌激素受体α（ERα）-溶质载体家族6成员14（Slc6a14）-Hippo信号通路来增强肠干细胞介导的上皮屏障完整性。这项研究突出了BL和肠道细菌衍生EVs在缓解MI患者梗死后心血管事件方面的潜力。
2 材料与方法
（此部分详细描述了实验材料、动物模型、方法学，包括BL粉末制备、动物实验设计、抗生素处理、FMT、细菌定植、L-EVs干预、MI小鼠模型构建、16S rRNA基因测序、超声心动图测量、TTC染色、组织学分析、TUNEL染色、免疫荧光和免疫组化、LPS测定、L-EVs分离与鉴定、电子显微镜和NTA、L-EVs蛋白质组学和代谢组学分析、L-EVs稳定性、血液相容性和生物安全性评估、体内生物分布、体外荧光标记检测、结肠类器官培养与处理、RNA-seq分析、qRT-PCR和统计分析。具体细节参见原文“2 Materials and Methods”部分。）
3 结果
3.1 BL减轻MI后心脏功能障碍和不良重塑
为确定膳食BL是否影响MI后心脏功能和心肌损伤，研究人员用标准饲料（CD）或等热量补充2.5% BL的饲料喂养小鼠3周，然后进行假手术或永久性左冠状动脉前降支结扎。术后第7天的超声心动图分析显示，BL补充通过显著降低左心室收缩末期内径（LVIDs）和左心室舒张末期内径（LVIDd），同时增加左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）来改善左心室功能障碍。通过TTC染色和伊文思蓝确定的危险区域显示，补充BL大大减少了梗死面积和危险区域。马松三色染色也证实，BL喂养的小鼠在MI后第7天纤维化瘢痕大小显著减少。由于过度的胶原沉积导致左心室扩张、心脏功能障碍和不良重塑，研究人员通过免疫荧光分析胶原蛋白III沉积，发现BL喂养的MI小鼠与对照MI小鼠相比，胶原蛋白III积累减轻。MI后心肌细胞凋亡是影响心室重塑程度的重要因素。TUNEL染色显示，与对照MI动物相比，BL喂养的MI小鼠在梗死区域TUNEL阳性心肌细胞和非心肌细胞的出现减少。此外，与对照MI小鼠相比，BL喂养小鼠梗死部位由CD31表达细胞标记的血管生成得到缓解。通过Ly6G染色对小鼠梗死部位的中性粒细胞进行心脏炎症测定，发现MI诱导的中性粒细胞浸润在BL喂养的小鼠中得到显著改善。重要的是，BL的心脏保护作用呈剂量和时间依赖性。这些数据一致证明，BL可防止MI诱导的心脏功能障碍和心肌损伤。
3.2 BL缓解MI小鼠肠道屏障功能障碍和肠道菌群失调
MI诱导的肠道屏障功能障碍驱动肠道细菌和微生物产物易位进入体循环，从而激活过度的免疫炎症，进一步导致心脏功能受损。因此，研究人员接下来探索了BL对肠道屏障功能和细菌衍生LPS易位的影响。HE染色和AB染色显示，与对照小鼠相比，BL喂养的小鼠在MI后第7天MI诱导的上皮损伤显著减少，产粘蛋白的杯状细胞数量增加。此外，与对照MI小鼠相比，BL喂养的MI小鼠结肠组织中Claudin-3和ZO-1的蛋白水平升高。研究人员还检测了血清细菌LPS（肠道通透性增加和细菌易位的全身标志物），其在BL喂养的小鼠中持续降低。这些结果表明，BL逆转了肠道屏障功能障碍并阻止了LPS易位，这可能是改善MI后病理结局的潜在因素之一。
先前研究表明，肠道屏障功能障碍会引发肠道微生物群落紊乱，这参与MI的发病机制。为了确定BL的心脏保护作用是否与调节肠道菌群有关，研究人员对假手术和MI小鼠喂养或不喂养BL7天后的粪便样本进行了高通量16S rRNA基因测序。在质量控制后，从20个测定样本中产生了910068条序列用于后续分析。通过Chao指数和Shannon指数测量的粪便菌群α多样性在四组之间没有显著差异。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示四组之间存在不同的肠道微生物群落结构。这些数据表明，补充BL可以有效重塑肠道菌群的组成。
研究人员进一步分析了门和属水平的肠道细菌组成。正如先前报道，每组小鼠的粪便菌群以拟杆菌门和厚壁菌门为主。MI小鼠的厚壁菌门和疣微菌门的相对丰度增加，而BL补充后其丰度降低。在属水平的进一步分析显示，假手术+CD组以norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group为主，而MI+CD组则表现出Faecalibaculum和Blautia的丰度显著增加。令人惊讶的是，假手术+BL和MI+BL组在属水平上表现出相似的微生物组特征，即Lachnospiraceae_NK4A136_group的丰度急剧增加。此外，通过线性判别分析效应大小（LEfSe）分析研究了差异细菌分类群，在补充BL的假手术和MI小鼠中均观察到Lachnospiraceae_NK4A136_group的丰度显著高于相应的CD喂养小鼠。总之，这些数据表明BL可以防止肠道菌群失调，而毛螺菌科的富集可能介导了BL的心脏保护作用。
3.3 BL通过肠道微生物组减轻心肌损伤
为确定肠道菌群是否在BL介导的MI后心脏修复改善中起作用，研究人员向CD和BL喂养的小鼠施用抗生素3周以耗竭肠道细菌，然后进行永久性冠状动脉结扎诱导MI。抗生素处理极大地取消了BL对肠道屏障功能障碍和细菌衍生LPS易位的改善作用。值得注意的是，当小鼠接受抗生素处理时，未观察到BL诱导的梗死面积和危险区域的减少。尽管BL在抗生素处理的MI小鼠中仍减轻了纤维化瘢痕大小，但对胶原积累的改善被抗生素处理所取消。此外，BL未能减轻MI诱导的心肌损伤，这在梗死区域的TUNEL阳性细胞数量上得到揭示。在施用抗生素的BL喂养MI小鼠的梗死部位，血管生成和中性粒细胞浸润的改善也受到削弱。这些结果表明，肠道菌群参与了BL的心脏保护作用。
3.4 BL的心脏保护作用可通过肠道菌群移植转移
为了验证BL的保护作用是否由肠道微生物群落的变化所介导，研究人员进行了FMT。将来自CD或BL供体小鼠的菌群移植移植到受体小鼠，然后诱导MI。通过16S rRNA测序检查FMT对肠道细菌组成的影响。PCoA分析显示，接受CD供体小鼠菌群的小鼠与接受BL供体小鼠菌群的小鼠的肠道菌群是分开的。重要的是，与对照受体小鼠相比，接受BL喂养小鼠菌群的小鼠显示出Lachnospiraceae_NK4A136_group的丰度增加。这些结果表明，供体的粪便菌群组成在受体小鼠中成功复制。
研究发现，与接受对照小鼠菌群的小鼠相比，接受BL喂养小鼠菌群的小鼠血浆LPS水平显著降低。结肠组织的进一步组织学分析显示，接受BL喂养小鼠菌群的小鼠表现出上皮损伤减少和粘液分泌增加。免疫组化染色也显示，接受BL喂养小鼠菌群的小鼠结肠中Claudin-3水平升高。通过超声心动图分析，研究人员观察到，与接受CD喂养小鼠菌群的小鼠相比，接受BL喂养小鼠菌群的小鼠具有更好的心脏功能。此外，与接受CD喂养小鼠菌群的小鼠相比，接受BL喂养小鼠菌群的小鼠表现出改善的梗死面积、心肌损伤、心脏纤维化和中性粒细胞浸润，尽管血管生成没有明显改善。总之，这些数据表明，BL诱导的肠道微生物组成变化足以改善MI的严重程度，并是BL心脏保护作用的原因。
3.5 BL介导的毛螺菌科富集减轻MI
由于Lachnospiraceae_NK4A136_group被鉴定为BL补充下富集的关键菌属，研究人员推测毛螺菌科可能是促成BL心脏保护作用的关键调节因子。为验证这一假设，研究人员将活的或热灭活的毛螺菌科灌胃给予抗生素处理的小鼠8周，然后通过结扎左冠状动脉前降支诱导MI。尽管研究人员发现毛螺菌科处理的MI小鼠和盐水处理的MI小鼠之间的组织学损伤没有显著差异，但活的毛螺菌科显著改善了受损的肠道屏障，表现为结肠紧密连接蛋白表达水平升高和血清LPS水平降低。相应地，给予活的毛螺菌科的MI小鼠的梗死面积、心脏纤维化、血管生成、心肌损伤和中性粒细胞浸润均显著减轻。然而，热灭活的毛螺菌科未能产生这些心脏保护作用。这些结果表明，毛螺菌科可以缓解肠道屏障功能障碍，防止LPS易位，从而保护小鼠免受MI后心脏重塑和功能恶化。
3.6 毛螺菌科衍生胞外囊泡（L-EVs）的制备和表征
新出现的证据强调了肠道细菌衍生EVs作为对健康和疾病有重大影响的关键介质的重要作用。然而，它们在MI心脏保护中的潜在作用尚未得到广泛研究。培养的毛螺菌科的超微结构分析显示，囊泡样结构存在于单个细菌细胞的表面。通过一系列过滤和离心步骤，研究人员从毛螺菌科培养上清液中获得了EVs。透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）图像显示，纯化的毛螺菌科EVs是具有球形形态的膜封闭结构。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，这些L-EVs的平均尺寸范围在100至200纳米直径之间。这些结果表明，毛螺菌科分离株可以释放丰富的纳米级囊泡。
研究人员接下来进行了蛋白质组学分析以确定L-EVs的蛋白质组学特征。通过将原始文件与UniProtKB中的毛螺菌科数据库进行比对，共鉴定出4971种蛋白质。其中，3265种蛋白质是毛螺菌科及其分泌的EVs所共有的。毛螺菌科特有的蛋白质数量为1690个，而L-EVs有16个特有蛋白质。这些鉴定蛋白质的主成分分析（PCA）显示两组之间存在明显分离。火山图显示，与亲本细菌相比，L-EVs中分别有462个和2528个蛋白质上调和下调。
研究人员接下来评估了差异表达蛋白质的功能潜力。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，这些蛋白质大多与代谢相关通路有关，包括碳代谢、甘油酯代谢、丙酸代谢、半乳糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、脂肪酸代谢、鞘脂代谢和谷胱甘肽代谢。L-EVs中的代表性通路通过GSEA绘制。值得注意的是，几种先前描述对维持肠道健康和改善炎症性疾病具有有益作用的蛋白质，如60 kDa分子伴侣蛋白和β-半乳糖苷酶。
基因本体（GO）注释用于根据生物过程、分子功能和细胞成分对蛋白质进行分类。与跨膜运输、翻译、细胞蛋白质代谢过程和ATP酶活性相关的功能在L-EVs中富集。具体而言，其中大多数被发现显著参与调节与磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信号通路、Toll样受体和AMPK通路相关的细胞内信号转导。这些结果表明，多种L-EVs蛋白质可能参与了毛螺菌科与宿主之间的相互作用。
3.7 L-EVs表现出良好的稳定性、生物安全性和结肠滞留特性
为评估L-EVs的稳定性，研究人员在模拟胃液中于37°C孵育L-EVs 2小时，然后在模拟肠液中于37°C再孵育2小时后测量其形态。观察到L-EVs的完整性保持良好，表明口服递送的L-EVs在通过胃肠道过程中可以保持稳定性。研究人员进一步通过溶血试验研究了L-EVs的血液相容性。观察到浓度为25–200 µg/mL的这些L-EVs不会诱导溶血，表明L-EVs具有良好的血液生物相容性。为评估L-EVs的生物安全性，小鼠连续7天口服给予50和100 µg/只剂量的L-EVs。收集主要器官组织和血液血清样本进行分析。L-EVs处理组和对照组之间的体重变化没有显著差异。主要器官的H&E染色显示，L-EVs处理组没有明显的异常或组织损伤。此外，与对照相比，血液生化指标包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清肌酐（CREA）和血清尿素（UREA）没有显著变化。
为确定L-EVs的组织分布，研究人员制备了DiR标记的L-EVs，然后通过口服灌胃给予小鼠。使用体内成像系统在不同时间点测量DiR标记的L-EVs的荧光强度，时间跨度为24小时。口服给药后，荧光信号主要在3小时时在腹部区域检测到，并逐渐减弱。口服给药3小时后，可以在结肠中观察到荧光信号，6小时时荧光最强。随后，检查了荧光信号在重要器官中的积累。肝脏中的荧光强度高于其他器官，并且在24小时时出现最大荧光强度。这些发现表明，L-EVs可以有效积聚在结肠中。
3.8 L-EVs治疗显著减轻MI严重程度
为 研 究 毛
打赏
