新型单链 DNA 适配体：流感 B 病毒检测的新希望

时间：2025年3月8日

来源：Virology Journal

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研究人员筛选鉴定出针对流感 B 病毒血凝素（HA）蛋白的单链 DNA 适配体，有望用于检测病毒，助力疾病诊断。

流感，这个大家并不陌生的 “健康杀手”，是一种极具传染性的急性呼吸道疾病。自新冠病毒（SARS-CoV-2）出现以来，2020 - 2021 年季节性流感病毒的传播大幅减少，但在 2021 - 2022 年又有所回升。流感病毒家族中的流感 B 病毒，是一种单链负义 RNA 病毒，其表面有一种至关重要的糖蛋白抗原 —— 血凝素（Hemagglutinin，HA）。HA 不仅在刺激机体产生中和抗体方面发挥着关键作用，还特别容易发生抗原变异，这使得它成为开发抗病毒药物和疫苗的重要靶点。

流感 B 病毒主要感染人类，虽然它引发的疫情规模和严重程度通常比流感 A 病毒小，但也不容小觑。它常常引发季节性流行，还可能导致一系列并发症，这些并发症的危害有时甚至比流感 A 病毒引发的还要严重。近年来，流感 B 病毒导致的重症和死亡病例屡见不鲜，每年在所有流感病例中占比超过 20%。对于 50 岁及以上的人群，感染流感 B 病毒后的临床发病率和死亡率可高达 2.5%。而且，流感 B 病毒的症状与其他呼吸道感染，如 SARS-CoV-2、H1N1 等引起的症状极为相似，这给诊断带来了极大的困难。因此，在患者出现症状后尽快进行流感 B 病毒检测和诊断，对于及时有效治疗至关重要。

目前，全球用于诊断流感的方法主要有传统病毒分离培养、免疫检测和基于分子生物学的诊断技术这三种。传统方法依赖病毒分离和血清学检测，操作复杂且耗时久，不适合在临床广泛应用；分子生物学诊断技术，如 PCR 和荧光检测系统，不仅操作繁琐，成本也很高；免疫检测方法使用针对流感病毒抗原的特异性抗体，虽然灵敏度高，但抗体容易降解，获取成本也高。鉴于这些问题，DNA 适配体（aptamer）凭借其独特的结合特性，逐渐成为开发流感诊断方法的潜在分子。

为了解决流感 B 病毒检测面临的难题，广州中医药大学研究生院、南方医科大学第一临床医学院等单位的研究人员展开了深入研究。他们以流感 B 病毒的 HA 蛋白为靶分子，利用磁珠系统进化配体富集技术（magnetic bead systematic evolution of ligands by exponential enrichment，磁珠 - SELEX）筛选特异性适配体。研究成果发表在《Virology Journal》上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是磁珠 - SELEX 技术，通过九轮筛选，获得了与流感 B 病毒 HA 蛋白具有强结合力的富集 DNA 文库。接着，利用高通量测序确定了五个候选适配体。然后，采用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）和酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）技术对适配体进行表征，筛选出对靶蛋白亲和力和特异性最高的适配体。

下面来看具体的研究结果：

DNA 适配体的筛选：从第二轮筛选开始，研究人员采用反向筛选策略，以去除非特异性结合的序列。通过 qPCR 分析计算保留率，发现从第八轮筛选开始，阳性筛选的保留率超过了阴性筛选。第九轮筛选时，荧光定量 PCR 曲线呈上升趋势。对最终筛选阶段的文库进行高通量测序后，合成了多个备选序列，并通过 SPR 筛选出五个潜在适配体用于亲和力检测。
SPR 测定 DNA 序列的亲和力结合：SPR 检测显示，在环境温度下，DNA 序列与参考通道（用封闭剂处理）无结合。比较参考通道和靶蛋白通道的结合情况，发现 A573 DNA 序列对靶蛋白的亲和力最高，因此选择 A573 进行进一步研究。后续对流感 B HA 蛋白与 A573 序列相互作用的 SPR 分析，也证实了它们之间有很强的结合亲和力。
候选适配体的二级结构：利用 UNAfold 工具预测适配体 A573 的二级结构，发现它倾向于形成茎环结构。这种结构能够凭借独特的空间构象和碱基配对方式，特异性识别和结合靶分子，使适配体在复杂的生物环境中保持相对稳定的构象，从而增强其功能。
适配体 A573 对流感 B 血凝素的特异性：通过 ELISA 检测适配体 A573 的特异性，结果显示它能选择性地与流感 B 病毒 HA 蛋白结合，与牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）无相互作用，对 H1N1 HA 蛋白的结合亲和力也较低，这表明 A573 对流感 B 病毒具有选择性亲和力，不会与 H1N1 发生交叉反应。
适配体 A573 对流感 B HA 蛋白的亲和力：采用 ELISA 评估适配体 A573 的结合亲和力，计算得出其解离常数（K_d）为 10.25 nM，处于纳摩尔范围，最大结合容量（Bmax）为 0.616。

研究结论和讨论部分指出，流感病毒由于抗原漂移，每年都会引发大流行。流感 B 病毒通过其 HA 蛋白与细胞表面的唾液酸受体结合，进而感染细胞并在细胞内复制。在本研究中，研究人员利用 76 个核苷酸的随机文库，通过体外 SELEX 筛选，成功鉴定出能特异性结合流感 B 病毒 HA 蛋白的适配体。经过多轮筛选和鉴定，确定 A573 为对流感 B 病毒 HA 蛋白亲和力和特异性最高的适配体。目前，流感 B 病毒的诊断主要依赖核酸扩增技术，但这些方法存在局限性，急需开发新的高效检测方法。适配体作为单链寡核苷酸，具有独特的识别和结合靶分子的能力，且具有结构灵活、易于化学合成和修饰、稳定性好、无免疫原性等优点，在生物医学领域应用广泛。本研究中鉴定出的适配体，有望作为关键识别元件，用于开发基于适配体的传感器等快速检测系统，为流感 B 病毒的早期检测和治疗带来新的希望。