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细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展（三）

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细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展

博士生: 严明达
导 师: 郑仲承 研究员

中 国 科 学 院
上海生命科学研究院
生物化学和细胞生物学研究所

（续前）

1.5 转录因子的氧还调控

    如上所述，氧化应激可通过活化细胞信号通路，终了激活各种转录因子，诱导许多基因，包括转录因子本身及效应靶基因的表达。但就转录因子蛋白分子水平而言，氧化往往会影响其DNA结合能力、转录激活能力，下调其活性。表1-4列出了部分受氧还调控的转录因子。

    原癌基因产物Jun、Fos通过C端亮氨酸拉链区域的相互作用，组合成Jun/Fos 或Jun/Jun，即构成转录因子AP-1。其DNA结合域中保守Cys残基的氧还状态直接影响到AP-1 的活性。巯基修饰剂如N-乙基马来酰亚胺（NEM）、二酰胺可下调其活性，而还原剂如DTT则增强其DNA结合。用丝氨酸替代这些半胱氨酸可增强DNA结合能力，且可抵抗NEM或二酰胺的作用。而且，有趣的是这一突变恰恰天然发生在原癌基因v-jun中。Fos的Cys-Ser突变还可增强其转化能力，提示氧还调节参与了肿瘤发生。

表1-4. 受氧还调控的转录因子

    NF-κB由p50、p65组成，均存在与原癌基因Rel的同源（Rel同源域，RHD）。NEM、二酰胺的处理使NF-κB丧失DNA结合能力，而DTT、β-巯基乙醇则有增强作用。p50的氧化可导致RHD中Cys62的交联从而形成同源二聚体。与AP-1不同的是，Cyc62突变为Ser可导致DNA结合能力的下降，但能抵抗碘乙酸（IAA）的作用。

    其他转录因子如上游激活因子（USF）、核因子-Y（NF-Y）、甲状腺素转录因子-1（TTF-1）、糖皮质激素受体（GR）、牛乳头瘤病毒I型E2（BPVIE2）、核因子I家族（NFI），Oct-2, Erg-1, BZKF1, EB病毒的一个转录因子、GA-结合蛋白（GABP）、芳香烃（Ah）受体、激活转录因子（ATFs）、cAMP响应元件结合蛋白（CREB）等，也表现出氧还调控。点突变掉保守半胱氨酸可导致USF、NF-Y、TTF-1等的氧化剂抗性。有趣的是，c-Jun、c-Fos、 NF-κB、 Rel、Myb、 BPV1E2、 NFI中氧还敏感的半胱氨酸残基旁侧均为碱性氨基酸，如Jun Cys-272和Fos Cys-154的两侧均为赖氨酸和精氨酸(KCR)，可能与增强半胱氨酸残基的巯基反应活性相关。

    此外还有两个有特色的DNA转录响应元件，从它们的名称上就可看出与氧还调控的密切关系：ARE（抗氧化响应元件）和HRE（低氧响应元件）。ARE存在于大鼠/小鼠GST A2亚基、大鼠/人NAD(P)H:醌氧还酶 (QP)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶等与异生质代谢第II期相关的酶的基因5’调控区，具有保守序列G/ATGACNNNGC，受到化学刺激如亲电试剂、抗氧化剂、自由基生成剂的激活。当然元件的激活实际上是其结合的转录因子的活化，目前发现的ARE结合蛋白有Nrf2和MafK，前者在氧化剂刺激下激活，而后者正相反。HRE发现于EPO基因的调控区，是EPO响应低氧转录表达的关键。后又发现在糖解酶类、酪氨酸羟化酶、转铁蛋白受体、糖元合成酶类以及生长激素等基因中存在。核心序列为RCGTG。其上结合有HIF-1α/β、HIF-1α/ ARNT等二聚体构成的低氧响应转录因子，并有辅蛋白p300/CREB-binding protein的参与。氧还因子Ref-1对其的激活作用将在第二部分中叙述。

    但并非所有的转录因子都氧化敏感，如血清响应因子和CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）就不受氧还调控。

1.6双重氧还调节概念

    从上面的讨论可以看出，从受体、蛋白激酶直至转录因子的信号传递过程中，活性氧的氧化调节起着近乎相反的功能。也就是说，在信号通路的上游，细胞氧化态有助于信号的增强，而在通路的下游，还原态有助于转录因子的激活。这就导致了细胞信号转导的双重氧还调节概念的提出。其实这并不矛盾，因为信号的上下游处于细胞的不同空间，完全可以有不同的氧还微环境。下面就AP-1激活、NF-κB激活和细胞凋亡为例，以图示为主的方式阐述其中的双重氧还调节。

1.6.1 AP-1的激活 （图1-3）

    AP-1的激活是细胞信号传导研究中的经典途径之一。胞外的刺激如配体与受体的结合使受体酪氨酸激酶或相关激酶活化，招募如Grb2、Shc、Sos等接头分子的聚集，激活小G蛋白，进而激活MAP激酶的级链反应，磷酸化c-Jun和c-Fos，形成活化形式的AP-1转录因子转位入核。氧化剂可以激活其上游的MAPK级链，而还原剂NAC可阻断PC12细胞中神经生长因子（NGF）诱导的信号从Ras到MAPK的传递，从而抑制AP-1活化。但如前所述，AP-1的关键半胱氨酸必须保持还原态方能有DNA结合活性，所以在核内情况与上游正相反，细胞氧还因子Ref-1与Trx协同作用，保持AP-1的还原，从而激活其DNA结合能力和转录激活能力。

1.6.2 NF-κB的激活（图1-4）

    简单地说，胞外刺激激活NF-κB诱导激酶（NIK），NIK激活IκB激酶（IKK），IKK磷酸化IκB，磷酸化的IκB被蛋白酶体降解，而释放的NF-κB转位入核启动转录。抗氧化剂可以抑制TNFα或其他刺激引起的NF-κB的活化，抑制作用发生在IκB磷酸化这一步上。而NF-κB本身则在还原状态下有高活性。所以说，还原剂可直接激活NF-κB，却抑制其上游信号通路中的激酶，体现了一种双重调节方式。

1.6.3 细胞凋亡 （图1-5）

    细胞凋亡在生物正常发育中起着极其重要的作用，并与许多疾病的发生有关。从目前已初步建立的凋亡信号转导系统看，死亡刺激往往诱导细胞色素c从线粒体中释放、并开放线粒体膜上的通透转移（PT）孔道而使线粒体膜电位（Δψm）下降，导致凋亡活化因子-1（Apaf-1）的活化，并进一步使caspase-9的前体激活。活化的caspase级联最终可以激活DNA片断化因子（DFF）或caspase-激活的DNase(CAD)。此外，Δψm的下降还导致凋亡诱导因子（AIF）的释放。而抗凋亡蛋白Bcl-2阻止细胞色素c的释放和PT孔道的开放。另有证据表明Bcl-2直接与Apaf-1结合，抑制caspase的激活。另一方面，Fas-配体（FasL）和TNFα分别通过Fas相关的死亡域蛋白（FADD）和TNF受体1相关的死亡域蛋白（TRADD）激活caspase-8。

    中度的氧化刺激会引起凋亡，而更高浓度的ROS则引起细胞的坏死(Dypbukt et al. 1994)。到目前为止，已有许多条氧化诱导凋亡的通路被揭示。ROS可以通过诱导神经酰胺的生成(Verheij et al., 1996)、JNK的活化(Verheij et al., 1996; Ishikawa et al., 1997)、p53的活化(Tishler et al., 1993; Yin et al., 1998)、PI3-激酶调节蛋白p85的表达(Yin et al., 1998)、线粒体Δψm下降等多途径引发凋亡。而且凋亡过程本身也产生ROS。IL-3依赖的细胞被剥夺IL-3后所引起的凋亡之前就有ROS的生成(Hockenberry et al., 1993)，抗氧化剂可以减缓凋亡的发生。类似的也发生在TNFα(Goossens et al., 1995; Talley et al., 1995)、TGFβ(Sanchez et al., 1996)、p53(Johnson et al., 1996; Polyak et al., 1997)诱导的凋亡中。Bcl-2抗凋亡也部分归功于其作为抗氧化剂的功能，阻止了线粒体的氧化从而阻止ROS的生成(Kroemer G, 1997)。

    尽管氧化应激是细胞凋亡的促进因素，但凋亡机制的氧还调控是复杂的。NO可通过cGMP依赖的方式、以及直接的蛋白S-亚硝基化作用方式导致caspase的失活(Kim et al., 1997)，从而抑制凋亡的发生。H₂O₂刺激的细胞可以丧失响应Fas诱导凋亡的能力(Clement et al., 1996)。低浓度H₂O₂处理会导致caspase的激活，而高浓度时则发生caspase失活的细胞坏死(Hampton et al., 1997)。可见，双重的氧还调控同样也存在于凋亡信号通路中：氧化应激启动了上游凋亡机器，却又可以抑制下游凋亡效应器如caspase的活化。此外，活性氧还作为中间桥梁沟通了细胞凋亡与细胞存活两个对立的系统，因为氧化可激活MAPK、Akt，两者均有抑制细胞凋亡的倾向；H₂O₂还诱导Hsp27被磷酸化而激活，减轻氧化引起的蛋白质损伤(Huot et al., 1995)。

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