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胰岛素原C肽作用机制

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刘智慧 崔大敷

（中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）

关键词：C肽；糖尿病并发症；G蛋白偶联受体

中图分类号：Q58

    C肽是胰岛素原中连接AB两条链的连接肽。在胰岛β细胞分泌颗粒中，胰岛素原经蛋白酶裂解，形成等摩尔由AB链组成的胰岛素和C肽，然后分泌并进入血液。C肽的种族差异很大，其中人C肽含31个氨基酸。在胰岛素原分子中C肽对胰岛素原分子的折叠、二硫键的正确配对等分子结构的形成起重要作用，而血液中游离C肽的生理功能却一直不清楚。近来的研究发现，给予I型糖尿病大鼠超生理剂量的人C肽配伍胰岛素治疗，能防止血管、神经机能障碍^[1]，长期（3个月）给予胰岛素配伍C肽，可使I型糖尿病病人减少尿白蛋白排泄率， 改善肾功能和自主神经及感觉神经障碍^[2]。C肽的这些改善糖尿病并发症的作用与其刺激Na⁺, K⁺-ATPase和内源NO合酶的活性相关^[3,4]。

1. C肽及其类似物对血管功能的影响

    用30mmol/L葡萄糖诱导皮室肉芽组织模型（从大鼠后腿下部任一侧取下一块直径约2cm的圆形皮肤并将其边缘缝在塑料小室上，一周后用于实验）形成血管机能障碍，即血流量改变，然后给予100nmol/L浓度的C肽及其类似物，观测这些肽的活性^[1]。结果显示，大鼠C肽和人的C肽活力相似，这可能与二者之间序列的高度同源性有关；反身氨基酸顺序的C肽效果与天然C肽一致时没有活力；均由D型氨基酸构成的人C肽，在放射免疫分析中，对天然C肽识别灵敏度高达10pmol/L的多克隆抗体无法识别1nmol/L的D型C肽，但其功效仍与天然C肽一致，具体见图1^[1]。因此，Ido等人认为决定C肽生物活性的是氨基酸排列顺序，而非肽键的方向或手性，从而提出C肽可能不是与立体专一性受体结合起作用，而是类似于抗菌肽如cecropins,非手性地与膜脂质作用来行使其生理功能^[1]。

图1 皮室肉芽组织中，人C肽及其片段对30mmol/L葡萄糖诱导血管机能障碍（血流量）的调节100nmol/L肽与30mmol/L葡萄糖同时供给。效力以100nmol/L人C肽作用的百分数表示。因为各肽在降低30mmol/L葡萄糖诱导的¹²⁵I-白蛋白渗透性升高及血流量增大这两方面是等效的，因此图中只显示血流量。柱右侧括弧中数字为实验用皮室数目。与仅用30mmol/L葡萄糖处理的大鼠有显著不同（P<0.05）。

2. C肽及其类似物对Na⁺, K⁺-ATPase活性影响

    大鼠C肽在浓度10^-8-10^-6mol/L，同时Na⁺处于不饱和浓度时，能够增强正常大鼠肾小管Na⁺, K⁺-ATPase活性^[5]。Ohtomo等人利用合成大鼠C肽及其类似物，通过研究其对正常大鼠近曲小管Na⁺, K⁺-ATPase活性的影响，以确定其活性部位^[3]。结果显示其C端是一个活性部位，其C端4肽和5肽有92%和103%的活力（相对于完整的C肽分子），而去（27-31）后的C肽则无活力。合成的人C端5肽（EGSLQ），其中两残基与鼠的C端（EVARQ）相同，具有75%的活力。非末端的中部序列相对于完整的C肽，具有35%-80%的活力。中部的2个或3个Gly序列仅轻微刺激Na⁺, K⁺-ATPase活性，非天然的2、3、4或5个Ala序列无可测得的活力，但D-LG却有72%的活性，具体见表1^[3]。

表1 完整C肽，C肽片段，非天然的短肽片段以及对照组对大鼠肾小管细胞Na⁺, K⁺-ATPase活力的影响

表上为平均值±SEM。每组数据代表来自三只不同的大鼠肾小管6-10片段，18-30次测量的平均值。

    Ohtomo等人制备了Na⁺, K⁺-ATPase的膜制剂，以证明C肽是否直接作用于Na⁺, K⁺-ATPase，结果显示大鼠C肽、EVARQ、ELGGGPEAG/D-LG和L-LG对该膜制剂没有激活作用，证明C肽并非直接作用于Na⁺, K⁺-ATPase，而是间接的，可能是通过受体的途径^[3]。

3. C肽与G蛋白偶联受体

    肾小管用百日咳毒素预先处理，则C肽增强肾小管Na⁺, K⁺-ATPase活性的能力被阻断，当有FK506(Ca²⁺-钙调蛋白依赖的磷酸酶2B)存在时，也出现这种情况。以上结果暗示C肽刺激Na⁺, K⁺-ATPase活性，可能是通过激活与对百日咳毒素敏感的G蛋白偶联体的受体以及Ca²⁺依赖的细胞内信号传导途径^[5]。通过荧光相关光谱（fluores-cence correlation spectrocopy）技术，有人研究了C肽与细胞膜的结合^[6]。在单分子检测灵敏度的情况下测定配体与膜的结合，发现了荧光标记的C肽特异地结合于几种人细胞表面（四甲基若丹明标记，通过琥珀酰亚胺酯衍生物连接），并且在低纳摩尔浓度下与细胞表面的结合就达到了饱和。Scatchard 作图分析它与肾小管细胞的结合，显示存在高亲和力，K_ass>3.3×10⁹(mol/L)^-1。过量未标记的C肽可以竞争下来荧光标记的C肽，解离常数为4.5×10^-4s^-1。C端五肽同样可以取代膜结合的C肽，表明该片段为配体的膜结合部分。顺序打乱但氨基酸组成与天然C肽一致以及D型C肽不能竞争膜结合的荧光标记的C肽。同样，胰岛素、IGF-I、IGF-II和胰岛素原也不能竞争膜结合的荧光标记C肽。从C肽与培养的肾小管细胞、皮肤纤维细胞和隐静脉的内皮细胞结合来看，肾小管细胞单位细胞表面积结合位点最多。相反，脐带血管内皮细胞不与C肽结合，这与C肽能够刺激主动脉内皮细胞NO合酶活性，而对脐带血管内皮细胞NO合酶活性无影响是一致的^[4]。用百日咳毒素（已知它可以修饰G蛋白偶联受体）处理细胞，则这种结合停止，说明C肽结合到人细胞膜G蛋白偶联受体，然后激活Ca²⁺依赖的细胞内信号通道，导致增强Na⁺, K⁺-ATPase和内源NO合酶的活性。但目前的发现并不排除超生理剂量的C肽可能与膜脂质作用发挥功能^[6]。

    用同位素标记的方法分析配体受体结合，即在C肽N端加上¹²⁵I标记的Tyr,看它与肾小管细胞的结合，结果检测不到这种结合；而用FCS技术能够检测到这种结合。这说明用FCS分析方法比放射性标记更加灵敏^[6]。

4. C肽与脂囊和脂微团的作用

    在Ido等人提出C肽可能通过非手性地与膜脂质作用发挥生理功能^[1]后不久，就有人采用人工模拟细胞膜的方法来验证^[7]。他们制备了表2^[7]所示的脂囊有脂微团，其中相对的脂浓度以质量百分比表示，PC为磷脂酰胆碱、PG为磷脂酰甘油、PS为磷脂酰丝氨酸、LPC为溶血磷脂酰胆碱、LPS为溶血磷脂酰丝氨酸，含有溶血磷脂的混合物形成脂微团，其它的混合物形成脂囊。为了证明C肽是否插入脂双层形成离子通道，他们用圆二色散（CD）技术研究C肽与脂囊/脂微团的溶液中，其CD光谱没有明显的变化，即二级结构无变化，这说明C肽不会插入脂双层，否则它从极性溶液进入非极性膜时二级结构将发生变化^[8]。C肽与由PC:PS=4:1和10%胆固醇组成的脂囊在pH5条件下混合，上凝胶过滤柱，C肽与脂质体没有同时迁移，而是在不同时间洗脱下来，这说明C肽不会和脂囊结合。以上CD和凝胶过滤柱层析的结果都说明C肽并非在膜脂质上形成离子通道发挥作用，这与C肽序列本身不含有能够形成通道的肽的特征是一致的。可能C肽可以与膜或膜蛋白发生瞬间的作用以调节它们的功能，但上面的数据表明生理浓度下C肽与膜 不可能形成稳定的物理联系^[7]。

表2 用来研究C肽/脂类相互作用的脂囊和脂微团组成

    与脂囊和脂微团作用的实验说明，C肽不是通过和膜的非手性作用发挥生理作用的，尽管它在超生理浓度下可能与膜发生瞬间的作用。而荧光相关光谱技术得到的数据支持了C肽通过膜结合的受体立体专一性结合起作用。从C肽及类似物对肾小管Na⁺, K⁺-ATPase活性影响，显示C端五肽具有完整C肽的活性，与其它生物活性肽类似，很可能C端五肽是受体结合部位；中间段肽有一定的活性，但没有C端强，而去（27-31）后的C肽则无活力，中间包含Gly部分在少于10个残基时有活性，但随着身N端或C端延伸，活力降低，这不是典型的受体作用方式，说明C肽可能通过几种复杂模式或间接方式发挥作用^[3]。

    总之，C肽联合胰岛素能够改善I型糖尿病大鼠糖尿病并发症以及I型糖尿病病人肾功能和自主神经及感觉神经障碍等糖尿病并发症，说明C肽有望成为治疗糖尿病并发症的药物，将为广大糖尿病患者带来福音。

参考文献：

1. Ido Y et al.Science,1997,277:563-566

2. Johansson BL et al.Diabet Med,2000,17(3):181-189

3. Ohtomo Y et al.Diabetologia,1998,41:287-291

4. Forst T et al. Clin Sci,2000,98(3):283-290

5. Ohtomo Y et al. Diabetologia,1996,39:199-205

6. Rigler R et al. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(23):13318-13323

7. Henriksson M et al. Cell Mol Life Sci,2000,57(2):337-342

8. Gierasch L et al. Biochemistry,1989,28:923-930

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