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体内体外表达齐头并进——Promega篇[选购宝典]

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生物通原核表达技术专辑：作为分子生物学领域老牌厂家，Promega同样有很有特色的原核表达系统，不过纵观Promega近年的表现，似乎不满足于此，而是将目光投向了跨物种间的穿梭表达，以及越来越热的体外表达系统了。

    蛋白纯化，永远是蛋白表达后最令人关注的问题。Promega的 PinPoint™ Xa 表达系统则是巧妙利用了生物素作为亲和纯化的中介——将目的基因克隆到表达载体上的一段“神秘”多肽的DNA序列后面，这段‘神秘’多肽表达后在细胞体内会自然被生物素修饰，所以大肠杆菌表达出的融合蛋白就是已经被生物素标记了的融合蛋白——生物素化的融合蛋白可以在直接上亲和素纯化柱，进行高度专一的亲和纯化，最后用生物素就可以在非变性条件下洗脱产物——最后还需要Xa因子蛋白酶切将目标蛋白释放出来。这个系统利用“神秘”多肽自动在体内“生物素化”，不单方便产物检测、亲和纯化，而且得到的产物很多是可溶的，加上后继的亲和纯化条件温和，有助于得到活性的蛋白质。链霉亲和素碱性磷酸酶可直接通过“简化Western”的方法检测带生物素标签的融合蛋白质。

    这个系列含有三个载体，无论你想从哪里插入都有合适的表达框架。同时还含有一个专门作为对照的control载体。它含有氯素酶转乙酰基酶（CAT）基因，作为监控蛋白表达、纯化和加工条件的手段。载体都是利用tac启动子，它由lac启动子的-10区和trp启动子-35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，同样受LacI阻遏蛋白调控。产量据说通常可以达到1—5mg/L。用SoftLink™抗生物素蛋白亲和纯化树脂是专利技术，可将蛋白质以非变性形式洗脱出来。或者也可以利用TetraLink™ 四联抗生物素蛋白树脂对蛋白进行纯化。PinPoint 载体的特点是含有编码内源蛋白酶因子Xa(发音为ten a)的蛋白水解位点，使得纯化标签可从天然蛋白上分离。载体还带有方便得多克隆区域，便于构建融合蛋白。整个表达系统不过4000人民币，已经包含载体菌株检测试剂纯化柱和洗脱试剂等等，一如Promega产品的实惠价格。

多系统表达，东边不亮西边亮
    Flexi® 载体系统是一种用于定向克隆蛋白编码序列的、简单而功能强大的方法。它是以两种稀有的限制性内切酶：Sgf I 和 Pme I为基础。这两种酶在我们试验常用到的物种：人、大鼠、小鼠、线虫等中出现频率都非常小，一般情况都在5％一下。该系统提供快速、有效和保真度高的方法，在多种Flexi® 载体之间转移蛋白编码区，而无需重新测序。这一由酶和相关载体组成的系统，使得客户可以很方便地将设计的开放读码框架（ORFs）进行克隆，并可以根据不同的应用目的而使其在不同种类的载体之间转移。多系统表达载体除了Promega的这种之外，还有Invitrogen的Gateway技术和Qiagen的pQE-TriSytem载体。Invitrogen的Gateway技术有其杆装病毒和酵母表达系统的成功显得底气十足，但是它有个麻烦的地方，就是要先做入门载体，之后每次再进行位点专一重组转入表达载体。Qiagen是一个载体通杀，给它加上大肠杆菌、杆装病毒和哺乳动物的启动子，这么看来Qiagen好像是最方便的，但是原核和真核的RNA聚合酶识别序列毕竟是不同的，对其表达的效率存在一定质疑。
    Promega的多系统表达有个突出的地方是它不单有普通原核表达、融合原核表达、哺乳动物表达，它还有体外表达。从哺乳动物细胞中提取的或通过克隆化DNA在体外转录产生的mRNA，在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质，这些蛋白质可用于免疫沉淀实验或进行生物活性测定。一般用来进行体外表达的有兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物两种，这里有专门利用麦胚提取物的载体。

    Promega不需要构建入门载体，你在众多载体中先选择一个最有希望的就可以先进行表达了。载体的构建过程是经典的酶切、连接过程，利用Promega提供的酶混合溶液（SgfⅠ和PmeⅠ）在37℃温育半个小时，65℃使失活20分钟。将PCR产物纯化后与酶切后的载体室温连接1小时，可以发现Promega的酶切和连接相对传统的方法需时较短。由于载体本身在SgfⅠ与PmeⅠ酶切位点之间是一个致死基因，这样使得到阳性克隆的几率大大加大了。但是随之而来的问题是，这种载体的储存问题。普通的载体我们可以储存在大肠杆菌中，不断复制，不断繁殖，一次购买以后可以省下很多钱。但是载体上有致死基因就只能每次都向厂家购买了。

    好，现在你把重组质粒构建成功，转入含有DE3片段的大肠杆菌中，利用IPTG进行诱导，发现无法表达，或者表达后想利用其它载体也进行表达以进行比较。那么你可以将外源片段转移到其它载体上，Flexi®系统拥有以下几个载体：

    pF代表是Flexi®系统的质粒，每种载体都有两种不同抗性选择，A代表氨苄青霉素K代表卡那霉素。以上载体都含有体外表达的T7启动子，可以在体外进行表达。其中pF3A和pF3K WG (BYDV) Flexi®载体还含有SP6启动子，同时载体含有Barley
Yellow Dwarf Virus（GYDV）加强表达序列，有利于体外表达。pFN2A和pFN2K (GST) Flexi®载体加入了GST标签，有助于融合表达和纯化，同时可以利用TEV蛋白酶将GST切除。

    如下图我们构建好一个供体载体（即上面所说的第一次克隆）需要将上面外源片段转移到受体载体上时，首先将两个载体都进行双酶切，然后将它们混合，利用受体的抗性将重组的质粒筛选出来。凡是含有致死基因和A抗性的重组质粒都无法存活，所以剩下的都是重组过的质粒。利用在这种方法可以快捷地将外源片段在多个载体中转移，并且不需要重新测序鉴定。但是需要注意的一种情况是两个载体间的相互连接，这种情况出现的比较少，而且这种异源二聚体一般都不稳定。但是最好还是做个正、负选择鉴定，一块板涂A抗性，一块涂B抗性（或者用培养液更方便，看个人啦），只有在A上不长，在B上长的才是自己要的克隆哦。

    虽然，生物通原核表达技术专题中介绍了很多种原核表达系统，每个系统都有自己的特色和优点，可是，即使是我们了解得相当清楚的大肠杆菌细胞内的活动依然有很多未知因素，表达的成功与否依然会受限于各种客观甚至不可知的条件，还有时间的成本，所以，在科研和药物研发竞争越来越白热化的今天，许多人又重新将目光投向了体外表达——体外转录和体外翻译。如果你只是想要得到目的蛋白，那么只要有DNA模版，借助体外转录和翻译同样可以得到所需蛋白质，而且不受细胞生长的限制，也可以避免克隆的时间成本，整个过程似乎也更容易控制。近来Roche还特别推出一个体外蛋白合成的机器。Promega同样高瞻远瞩，P家的体外翻译系统相当全面。生物通将另文专门介绍.

附： 由William Linton 先生在1978年创建的Promega公司，总部位于位于美国威斯康辛州麦迪逊市。Promega公司早在1985年就开始进入中国市场目前在北京设有办事处。跟其它外国品牌比起来Promega公司的产品在价格上还是比较有竞争力的，而且产品获得ISO9001认证，质量也有保证。Promega公司今年还有促销活动，收集Promega公司产品包装盒上的“有效标签”换取Promega公司提供的免费礼品或者免费试用装产品。参加这项活动的产品包括限制性内切酶、修饰酶、核酸标准物、核酸纯化系统以及体外转录试剂盒等大部分Promega公司产品。免费礼品从便宜的蓝色陶瓷水杯到实用的维氏原装瑞士军刀，只要多多积分就行了。

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