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糖尿病肾病（DN）作为糖尿病的主要并发症之一，是导致终末期肾病的常见病因。随着糖尿病患病率的上升，DN 的发病率也在增加，严重威胁患者的健康和生命。尽管钠 - 葡萄糖协同转运蛋白 2（SGLT2）抑制剂等药物的出现改善了糖尿病的预后，但仍有大量患者发展为肾衰竭，死亡率居高不下，这主要归因于对糖尿病诱导的肾脏病理的具体分子事件了解不足
宾夕法尼亚州立大学医学院细胞与分子生理学系的研究人员 Siddharth Sunilkumar、Sandeep M. Subrahmanian 等人，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “REDD1 expression in podocytes facilitates renal inflammation and pyroptosis in streptozotocin-induced diabetic nephropathy” 的论文。该研究意义重大，深入揭示了糖尿病肾病（DN）发生发展过程中肾炎症和细胞焦亡的分子机制，为 DN 的治疗提供了潜在的新靶点，有望推动开发更有效的治疗策略，改善糖尿病患者的肾脏预后。
糖尿病肾病（DN）作为糖尿病的主要并发症之一，是导致终末期肾病的常见病因。随着糖尿病患病率的上升，DN 的发病率也在增加，严重威胁患者的健康和生命。尽管钠 - 葡萄糖协同转运蛋白 2（SGLT2）抑制剂等药物的出现改善了糖尿病的预后，但仍有大量患者发展为肾衰竭，死亡率居高不下，这主要归因于对糖尿病诱导的肾脏病理的具体分子事件了解不足。
炎症在 DN 的发生发展中起着关键作用，被认为是导致肾功能障碍的重要因素。转录因子核因子 κ - 轻链增强子（NF - κB）在介导炎症和免疫功能方面发挥重要作用，其活性在糖尿病患者的肾脏和糖尿病临床前模型中均增强。NF - κB 可促进多种促炎细胞因子（如 TNFα、IL - 6 和 IL - 1β）和趋化因子（如 CCL2 和 RANTES）的表达，这些炎症细胞因子不仅调节免疫反应，还会导致肾脏损伤。
此外，无菌炎症在 DN 中常归因于 NOD 样受体（NLR）家族含 pyrin 结构域 3（NLRP3）炎性小体复合物的激活，该复合物的激活与糖尿病肾脏疾病密切相关，可导致细胞焦亡，这是一种促炎性的细胞死亡形式。
应激反应蛋白 REDD1（Regulated in Development and DNA Damage 1）在糖尿病患者的肾脏以及糖尿病临床前啮齿动物模型中均上调。此前研究表明，全身 REDD1 缺失可预防糖尿病小鼠的白蛋白尿、肾脏损伤和足细胞丢失，但 REDD1 在糖尿病诱导的肾脏免疫反应中的作用尚未完全阐明。因此，本研究旨在探讨 REDD1 依赖性信号在肾脏炎症发展中的作用。
研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及 ARRIVE 指南，实验方案获得宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。选用雄性小鼠，6 周龄时随机分组。通过连续 5 天腹腔注射 50mg/kg 链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病，以空腹血糖浓度 > 250mg/dL 确认糖尿病表型，非糖尿病小鼠给予柠檬酸钠缓冲液作为对照。部分糖尿病小鼠从诱导糖尿病 14 周后开始，每天腹腔注射 1mg/kg 达格列净（DG）控制高血糖。实验使用了野生型、REDD1 基因敲除（）小鼠以及通过杂交获得的足细胞特异性 REDD1 基因敲除（PodKO）小鼠。16 周糖尿病病程后，采集尿液和肾脏样本进行后续分析。
对 10% 福尔马林固定、石蜡包埋的肾脏进行切片（6μm），分别进行免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）染色。IHC 染色后用苏木精复染，使用显微镜拍照；IF 染色用 Hoechst 33342 复染细胞核，通过共聚焦激光显微镜成像。免疫细胞化学分析时，细胞经固定、通透、封闭后与相应抗体孵育，用 DAPI 染细胞核，最后用荧光封片剂封片并成像。
将肾脏组织消化制成细胞悬液，经一系列处理去除细胞碎片和红细胞，然后用 Fc 阻断剂孵育，再与抗体标记，最后用流式细胞仪分析肾脏免疫细胞群体。
条件永生化人足细胞（CIHP - 1）和人白血病单核细胞 THP - 1 细胞分别按照特定方法培养和分化。利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建稳定的 CIHP - 1 REDD1 基因敲除细胞系，并通过转染质粒进行相关实验。实验设置高糖（30mM 葡萄糖，HG）和渗透压对照（5mM 葡萄糖 + 25mM 甘露醇，OC）条件处理细胞。
提取细胞或肾皮质组织的核蛋白或总蛋白，进行蛋白质免疫印迹分析。使用 ELISA 法测定 IL - 1β 蛋白含量，通过蛋白质免疫印迹和定量分析 CCL2 蛋白。利用 NF - κB p65 DNA 结合 ELISA 试剂盒测定肾组织中核 NF - κB 活性，使用 FAM - FLICA Caspase - 1 试剂盒检测足细胞培养物中活性 caspase - 1。
采用染色质免疫沉淀（ChIP）和定量 PCR（ChIP - qPCR）检测 NF - κB p65 与 CCL2 基因启动子区域的结合情况。
提取总 RNA，逆转录后进行定量实时 PCR，计算 mRNA 表达相对于 GAPDH mRNA 的变化。
将分化的 CIHP - 1 细胞接种于 Transwell 小室下室，给予高糖或渗透压对照处理，激活的 THP - 1 细胞接种于上室，迁移 24h 后固定、染色、成像，计数迁移细胞数量。
根据先前研究进行先验功效分析确定样本量，数据以均值 ± 标准差表示。多组数据采用单向或双向 ANOVA 分析，组间两两比较使用 Tukey 检验，用 Spearman 相关性分析尿白蛋白与肌酐比值（ACR）和血糖水平的关系，为差异有统计学意义。
研究人员首先通过动物实验，构建糖尿病小鼠模型，观察糖尿病对肾脏 REDD1 含量和免疫细胞浸润的影响，以及达格列净干预后的变化。接着，对比野生型和 REDD1 基因敲除小鼠在糖尿病状态下的各项指标，探究 REDD1 在肾脏炎症中的作用。在细胞水平，利用条件永生化人足细胞和人白血病单核细胞，通过基因编辑、转染质粒等技术，模拟高糖环境，研究 REDD1 对 NF - κB 激活、细胞因子表达、巨噬细胞趋化以及细胞焦亡的影响。综合动物实验和细胞实验结果，深入分析 REDD1 在糖尿病肾病中的作用机制。
与非糖尿病小鼠相比，STZ 诱导的糖尿病小鼠空腹血糖水平升高，肾脏皮质匀浆中 REDD1 蛋白含量增加，肾脏免疫细胞浸润增强。给予达格列净治疗后，血糖浓度降低，肾脏 REDD1 蛋白含量和免疫细胞浸润也随之减少。这表明糖尿病诱导的高血糖可促进肾脏 REDD1 蛋白丰度增加和免疫反应激活。
STZ 诱导的糖尿病小鼠肾脏中 REDD1 蛋白增加，而小鼠未出现白蛋白尿、促炎因子增加或肾巨噬细胞浸润。糖尿病增加了小鼠肾脏中 Ccl2、Il1b 等促炎基因的 mRNA 和蛋白表达，在小鼠中则无此现象。这说明 REDD1 是糖尿病肾病中增强肾脏炎性细胞因子和趋化因子表达所必需的。
通过对肾脏免疫细胞的标记和分析发现，糖尿病小鼠肾皮质中 F4/80 + 细胞数量增加，而小鼠未出现这种情况。STZ 糖尿病增加了肾脏中 CD45 + 细胞、CD11b + F4/80 + 巨噬细胞和 CD86 + M1 巨噬细胞的数量，REDD1 缺失可阻止这些变化。这表明 REDD1 表达是糖尿病小鼠肾脏中促炎先天免疫反应升高所必需的。
在糖尿病小鼠肾脏中，NF - κB 信号通路相关蛋白发生变化，NF - κB 激活增强，而小鼠中糖尿病诱导的 NF - κB 激活减少。在体外实验中，高糖条件促进了 CIHP - 1 足细胞中 IκBα 降解、p65 NF - κB 亚基磷酸化、NF - κB 核定位和荧光素酶报告基因活性增加，REDD1 缺失可阻止这些效应。ChIP - PCR 分析表明，高糖条件下野生型细胞中 p65 与 CCL2 启动子结合增加，REDD1 缺失细胞则无此现象。这说明 REDD1 在高糖条件下对足细胞中 NF - κB 激活既必要又充分。
Transwell 迁移实验显示，高糖条件下野生型 CIHP - 1 细胞与 THP - 1 巨噬细胞共培养时，巨噬细胞迁移增加，而 REDD1 缺失的 CIHP - 1 细胞则无此现象。在体内实验中，足细胞特异性 REDD1 基因敲除（REDD1 PodKO）小鼠在糖尿病诱导后，尿 ACR 未增加，肾脏中 CCL2 蛋白水平和 F4/80 + 免疫细胞浸润也未增加，且 M1 巨噬细胞群体减少。这表明足细胞中 REDD1 表达促进了糖尿病时肾脏促炎巨噬细胞的浸润。
在足细胞培养中，高糖条件增加了 NLRP3 mRNA 表达、NLRP3 蛋白丰度、caspase - 1 活性、Gasdermin D（GSDMD）切割和 LDH 释放，这些变化依赖于 REDD1。在糖尿病小鼠肾小球中，Nlrp3 mRNA 表达、NLRP3 和 GSDMD 蛋白含量增加，而在 REDD1 PodKO 小鼠中这些增加被抑制。免疫荧光显微镜显示，糖尿病小鼠中 NLRP3 和 GSDMD 与足细胞标记蛋白 nephrin 共定位增加，REDD1 PodKO 小鼠则无此现象。这表明糖尿病诱导的 REDD1 表达介导了足细胞中 NLRP3 相关的细胞焦亡。
本研究表明，糖尿病时足细胞中 REDD1 表达通过激活 NF - κB 信号通路，促进促炎细胞因子和趋化因子的产生，进而导致肾脏免疫细胞浸润、巨噬细胞极化以及 NLRP3 炎性小体相关的细胞焦亡。足细胞特异性 REDD1 缺失可减轻糖尿病小鼠肾脏的炎症反应，保护肾小球结构和过滤功能，减少足细胞丢失。
炎症在 DN 的病因学中起着关键作用，本研究进一步明确了 REDD1 在糖尿病诱导的肾脏炎症中的重要作用。高血糖是 DN 发展和进展的决定因素，STZ 诱导的糖尿病小鼠模型虽存在品系依赖性差异，但仍有助于研究糖尿病相关的肾脏炎症。REDD1 在多种细胞类型中对糖尿病条件作出反应而上调，SGLT2 抑制剂降低血糖可减少肾脏 REDD1 蛋白丰度和免疫细胞浸润。
REDD1 在调节细胞和代谢功能方面具有重要作用，并且在包括糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病在内的代谢性疾病发病机制中起作用。越来越多的证据表明 REDD1 具有促炎作用，本研究数据进一步支持了 REDD1 在糖尿病肾病中驱动免疫信号传导的机制，即 REDD1 对 NF - κB 激活、细胞因子和趋化因子表达增加以及免疫细胞浸润是必需的。
足细胞功能障碍和丢失是 DN 发病的早期事件，REDD1 在足细胞中对 NF - κB 激活和炎症细胞因子、趋化因子产生至关重要。体外实验表明高糖诱导的足细胞 REDD1 是巨噬细胞趋化所必需的，体内实验证实足细胞特异性 REDD1 缺失可减少免疫细胞浸润和 M1 巨噬细胞募集。
此外，炎症小体的激活在糖尿病并发症中很常见，在糖尿病肾病中，细胞焦亡促进了足细胞损伤和肾脏免疫细胞浸润，足细胞特异性 NLRP3 炎性小体激活可导致肾小球功能障碍和肾脏损伤。本研究发现 REDD1 表达是足细胞中 NF - κB 依赖性 NLRP3 炎性小体激活和细胞焦亡所必需的。
目前 DN 的治疗主要集中在控制血糖，未能解决其根本原因。本研究揭示了糖尿病导致肾脏炎症的具体分子事件，为开发新的治疗方法提供了理论依据。针对 REDD1 的干预措施，尤其是在足细胞中特异性抑制 REDD1 的疗法，有望改善 DN 和急性肾损伤等肾脏疾病的治疗现状。
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