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为解决肝癌治疗难题，复旦大学附属肿瘤医院的研究人员开展 FAM99B 相关研究。发现 FAM99B 可抑制核糖体生成和肝癌进展，GalNAc - FAM99B65 - 146 有治疗潜力。该研究为肝癌治疗提供新思路，值得科研人员阅读。
复旦大学附属肿瘤医院（Fudan University Shanghai Cancer Center）的研究人员 Yifei He、Hongquan Li 等人在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “The liver-specific long noncoding RNA FAM99B inhibits ribosome biogenesis and cancer progression through cleavage of dead-box Helicase 21” 的论文。这篇论文在肝癌研究领域意义重大，为肝癌的治疗提供了全新的思路和潜在的治疗策略。
肝癌是全球范围内严重威胁人类健康的疾病，原发性肝癌在全球癌症发病率中位居第六，是男性癌症相关死亡的第二大原因，女性癌症死亡的第六大原因 ，肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）患者的 5 年生存率仅约 20%。肝癌预后差，主要是因为其早期症状不明显，导致诊断往往较晚，而且对传统的化疗和放疗有很强的耐药性。因此，深入研究 HCC 发生发展的机制、寻找新的肿瘤标志物和开发新的治疗方法，对延长患者生存期至关重要。
长链非编码 RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）在肿瘤中发挥着关键的调控作用，越来越多地应用于癌症治疗。LncRNA 可以通过影响染色体沉默、基因组印记、染色质重塑、转录调控和核运输等过程，调节肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和化疗耐药性 ，从而影响肿瘤的发生和发展。越来越多的证据表明，lncRNA 是癌症治疗有前景的靶点或治疗剂。多种基于 RNA 的治疗剂和策略不断涌现，如反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASOs）、小干扰 RNA（Small interfering RNAs，siRNAs）、短发夹 RNA（Short hairpin RNAs，shRNAs）、miRNA 模拟物、治疗性环状 RNA（Therapeutic circular RNAs，circRNAs）以及基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑技术等。
在肝脏中，组织特异性 lncRNA 通常具有特殊功能。值得注意的是，大多数肝脏特异性 lncRNA 在肝癌中表达缺失，并且通常抑制肿瘤的发展和进展。因此，调节这些肝脏特异性 lncRNA 的表达，成为基于 lncRNA 的 HCC 基因治疗的潜在策略。
此前有研究报道，源自人脐带间充质干细胞外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived exosomes，hucMSC-Exo）的 FAM99B 可诱导细胞周期停滞和凋亡，抑制 HCC 的发展和进展 。也有研究预测 FAM99B 参与 “代谢途径” 和 “血液凝固 ” 途径，还与伤口愈合反应、脂质生物合成和脂质代谢调节有关 。然而，FAM99B 在肿瘤中的分子机制尚未得到实验验证和深入探索。
DDX21（Dead-Box Helicase 21）是 DEAD-box 家族成员，是一种 RNA 解旋酶，利用 ATP 水解产生的能量催化双链 RNA 或 RNA-DNA 杂交体解旋。它是重要的核仁蛋白，参与核糖体 RNA（ribosomal RNA，rRNA）加工，在核糖体生物发生的多个步骤中发挥作用。此前研究表明，在多种细胞类型中，DDX21 缺失会导致 18S 和 28S rRNA 水平显著降低 。它还与多种人类癌症的发展有关，如乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、结直肠癌和神经母细胞瘤等，但在 HCC 中的作用尚未见报道。
体内实验：选用 6 周龄雌性无胸腺 BALB/c 裸鼠，分别进行皮下肿瘤形成实验和原位异种移植实验。在皮下肿瘤形成实验中，将过表达 FAM99B 或对照的 Huh7 细胞注射到裸鼠右腋窝，监测肿瘤生长速度并计算体积。原位异种移植实验则是将过表达 FAM99B 或对照的 Huh7 细胞注入裸鼠肝脏，以研究 FAM99B 对肿瘤侵袭的影响。此外，在 GalNAc - FAM99B65 - 146 治疗实验中，构建表达荧光素酶的 Huh7 细胞原位异种移植模型，对裸鼠进行分组并分别给予 GalNAc - NC 或 GalNAc - FAM99B65 - 146 处理，之后进行体内成像、组织取材及相关检测。
RNA 测序（RNA-seq）和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）：提取稳定过表达 FAM99B 和敲低 DDX21 的细胞 RNA，去除 rRNA 后构建 RNA - seq 文库。通过计算每个基因的每千碱基转录本每百万映射读数片段数（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads，FPKM）对读取计数进行标准化。选择 FAM99B 过表达后表达变化倍数＞1.5 或 DDX21 敲低后表达变化倍数＜0.67 的基因进行 GSEA 分析。
表面感知翻译（Surface Sensing of Translation，SUnSET）方法：用 10 μg/ml 嘌呤霉素处理 HCC 细胞 30 分钟，裂解细胞后用抗嘌呤霉素抗体进行蛋白质免疫印迹分析，以此监测整体蛋白质合成情况。
多聚核糖体分析（Polysome profiling）：用 100 μg/ml 环己酰亚胺处理 HCC 细胞，裂解细胞后用 RNase I 和 DNase I 处理，通过蔗糖垫层离心分离单体，测量 260 nm 处吸光度，分析核糖体亚基水平。
O - 炔丙基 - 嘌呤霉素（O - propargyl - puromycin，OP - Puro）测定：使用 Click - iT Plus OPP Alexa Fluor 488 蛋白质合成测试试剂盒，按照说明书进行操作，通过激光共聚焦显微镜或荧光激活细胞分选分析细胞荧光强度，评估蛋白质合成情况。
肝脏特异性 lncRNA FAM99B 在 HCC 中起抑癌作用：研究人员通过分析基因型 - 组织表达（Genotype - Tissue Expression，GTEx）数据库中的组织相关 RNA - seq 数据，筛选出众多组织特异性 lncRNA。再利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的肝癌（Liver Hepatocellular Carcinoma，LIHC）数据集，进一步筛选出 13 种在肝癌患者中表达下调且与更好预后相关的肝脏特异性 lncRNA 候选者，其中 FAM99B 几乎仅在肝脏中表达。分析多个 HCC 患者队列数据发现，FAM99B 在 HCC 中表达下调，且高表达与更好的预后相关。亚细胞定位显示 FAM99B 主要定位于肝细胞的细胞核。细胞实验表明，过表达 FAM99B 显著抑制 HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭；体内实验中，过表达 FAM99B 的肿瘤生长更慢、重量更轻，且细胞增殖率更低，同时过表达 FAM99B 还能显著抑制 HCC 细胞的转移。这些结果表明 FAM99B 是 HCC 中真正的抑癌基因。
FAM99B 通过与 DDX21 相互作用发挥生物学功能：为探究 FAM99B 抑制 HCC 细胞增殖和转移的分子机制，研究人员进行 RNA 下拉实验结合质谱分析，筛选出可能与 FAM99B 结合的蛋白，发现 DDX21 与 FAM99B 结合最为显著。免疫荧光染色显示 FAM99B 和 DDX21 在 HCC 细胞核中共定位。构建 DDX21 的截断突变体进行 RNA 免疫沉淀实验，发现 FAM99B 与 DDX21 的 C 末端结构域结合。功能实验表明，过表达 DDX21 促进 HCC 细胞的生长、集落形成、迁移和侵袭，而敲低 DDX21 则抑制这些行为。同时过表达 FAM99B 和 DDX21 时，DDX21 会消除 FAM99B 对 HCC 细胞的抑制作用。这表明 FAM99B 通过下调 DDX21 来减少 HCC 细胞的增殖和转移。
FAM99B 促进 DDX21 的核输出及其被 Casp3/6 切割：研究发现，过表达或敲低 FAM99B 不影响 DDX21 的 mRNA 水平，但过表达 FAM99B 会降低 DDX21 的蛋白质水平，敲低 FAM99B 则会增加其蛋白质水平。用蛋白酶体抑制剂、溶酶体抑制剂、钙蛋白酶抑制剂和泛半胱天冬酶抑制剂处理细胞后发现，泛半胱天冬酶抑制剂 Z - VAD - FMK 可抑制 FAM99B 诱导的 DDX21 蛋白水平下调。干扰 Huh7 和 HepG2 细胞中不同的半胱天冬酶家族成员表达，发现干扰 caspase3 和 caspase6 可逆转 FAM99B 过表达导致的 DDX21 下调。进一步研究发现，FAM99B 过表达会使 DDX21 从细胞核转移到细胞质，敲低核输出蛋白 XPO1 可抑制这种转移。共免疫沉淀实验表明，FAM99B 过表达增强了 DDX21 与 XPO1 的相互作用。此外，转染含 Flag 标签的野生型 DDX21 和 DDX21D126A 突变体质粒发现，FAM99B 通过 casp3/6 在 D126 位点介导的切割促进 DDX21 的输出和降解。
FAM99B 通过抑制 DDX21 表达抑制 HCC 细胞的 mRNA 翻译：对过表达 FAM99B 或敲低 DDX21 的 HCC 细胞进行 RNA - seq 和 GSEA 分析，发现核糖体途径相关基因在 FAM99B 过表达和 DDX21 沉默的细胞中显著下调。SUnSET 和 OP - Puro 实验表明，敲除 FAM99B 会增加整体蛋白质合成，而过表达 FAM99B 则会降低蛋白质合成，过表达 DDX21 可逆转 FAM99B 过表达导致的蛋白质合成减少。敲低 DDX21 也会显著降低整体翻译活性。这些结果表明 FAM99B 通过下调 DDX21 的表达抑制 HCC 细胞的蛋白质翻译。
FAM99B 通过调节 rRNA 加工和 RPS29/RPL38 转录抑制核糖体生物发生：由于 DDX21 参与 rRNA 转录、加工和修饰，研究人员检测了 Huh7 细胞中各种前体 rRNA 和成熟 rRNA 的丰度。结果显示，FAM99B 过表达细胞中 47/45S 前体 rRNA 和 30S 前体 rRNA 积累，而 21S 和 18S - E 前体 rRNA 信号减少，恢复 DDX21 表达可挽救这种表型，敲低 DDX21 也有类似效果，表明 FAM99B 和 DDX21 可调节前体 rRNA 在 A 位点的加工。ChIP - seq 实验发现 DDX21 在 RPS29 和 RPL38 启动子处富集，敲低 DDX21 会减少其在启动子处的富集，降低 RPS29 和 RPL38 的 mRNA 和蛋白质表达水平，说明 DDX21 调节 RPS29/RPL38 的转录。多聚核糖体分析显示，FAM99B 过表达和 DDX21 沉默细胞中的 40S 和 60S 亚基减少，过表达 DDX21 可逆转这种减少。这表明 FAM99B 通过调节 rRNA 加工和 RPS29/RPL38 转录影响核糖体生物发生。
FAM99B65 - 146 片段在 HCC 细胞中起抑制作用：为探索 FAM99B 在 HCC 中的潜在治疗作用，研究人员构建了多个 FAM99B 截断片段，通过 RNA 下拉实验确定与 DDX21 结合的片段为 FAM99B65 - 146。过表达 FAM99B65 - 146 可抑制 Huh7 和 HepG2 细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭，下调 DDX21 蛋白水平，抑制核糖体生物发生和蛋白质合成，而缺失该片段的 FAM99BΔ65 - 146 则无此作用。这表明 FAM99B65 - 146 是与 DDX21 结合的区域，可发挥抑制 HCC 细胞的作用。
GalNAc - FAM99B65 - 146 给药有效抑制原位异种移植肿瘤的生长和转移：GalNAc 是肝细胞表面唾液酸糖蛋白受体的天然配体，可用于肝脏靶向递送。研究人员合成 GalNAc - FAM99B65 - 146 后发现，其在 Huh7 细胞中过表达效率可达 25 倍，且能抑制 Huh7 细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭。在原位异种移植模型中，给予 GalNAc - FAM99B65 - 146 的裸鼠肿瘤生长速度明显减慢，Ki67 表达降低，肝内转移减少，肿瘤组织中 DDX21 蛋白水平显著降低。同时，治疗过程中裸鼠体重无明显下降，FAM99B65 - 146 主要在肝脏组织中保留，未在肺组织积累，表明其在小鼠中无明显毒性。这些结果表明 GalNAc - FAM99B65 - 146 是治疗 HCC 的潜在策略。
本研究发现肝脏特异性 lncRNA FAM99B 在 HCC 中经常下调，发挥抑癌作用。FAM99B 通过与 DDX21 结合，招募 XPO1 促进 DDX21 的核输出，DDX21 在细胞质中被 caspase3/6 在 D126 位点切割降解。FAM99B 通过 DDX21 抑制 rRNA 加工和 RPS29/RPL38 转录，减少核糖体生物发生和蛋白质合成，从而抑制 HCC 细胞在体内外的增殖和转移。
此前虽有研究提及 FAM99B 对 HCC 细胞的抑制作用，但未深入探究其分子机制。本研究首次揭示了 FAM99B 在 HCC 中的全新生物学作用机制，明确了其与 DDX21 的相互作用关系，以及对核糖体生物发生和蛋白质合成的调控机制。同时，发现了 FAM99B65 - 146 片段的重要功能，为后续基于 FAM99B 的治疗策略开发提供了关键依据。
在癌症治疗领域，多数研究将 lncRNA 作为治疗靶点，而本研究首次将 lncRNA 作为治疗剂应用于肿瘤治疗。GalNAc - FAM99B65 - 146 能够有效抑制原位 HCC 异种移植瘤的生长和转移，为 HCC 的治疗提供了新的策略和方法，为 lncRNA 在基因治疗中的应用开辟了新的方向。不过，目前该研究仍处于基础研究阶段，未来还需要进一步开展临床试验，验证 GalNAc - FAM99B65 - 146 在人体中的安全性和有效性，探索最佳的给药方式和剂量，为 HCC 患者带来新的希望。
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