为了深入探究这一问题，研究人员开展了一系列研究。他们为两种海洋哺乳动物 —— 宽吻海豚（Tursiops truncatus）和斑海豹（Phoca largha），以及它们的一种陆地近亲猪獾（Arctonyx collaris）构建了高质量的染色体水平基因组。同时，利用 Hi-C 技术重建了宽吻海豚、斑海豹、猪獾和山羊（Capra hircus）的高分辨率全基因组染色质相互作用图谱，为后续研究奠定了坚实基础。

在基因组组装和分歧时间估计方面，研究成果显著。借助 PacBio SMRT 长读长测序、短读长测序、BioNano 光学图谱和 Hi-C 技术，成功获得了高质量的基因组组装。宽吻海豚、斑海豹和猪獾的基因组大小分别约为 2.36Gb、2.41Gb 和 2.61Gb，支架 N50 长度范围从 115.7Mb（宽吻海豚）到 179.7Mb（斑海豹），质量评估显示短读长映射率高，一致性质量得分超过 26.3，且基因组组装的连续性和准确性优于先前报道。基于同源性、从头预测和转录组预测模型，在三种动物中分别鉴定出数量可观的蛋白质编码基因，基因组装完整性良好。通过分析 8425 个一对一的直系同源基因构建的系统发育树，与先前的哺乳动物物种树高度一致，且分歧时间估计表明鲸类与偶蹄目动物的分化以及斑海豹与猪獾的分化均发生在古近纪。

海洋哺乳动物中存在着趋同的氨基酸替换现象。研究人员分析了 50 种哺乳动物（包括 26 种海洋物种和 24 种陆地物种）的 4692 个直系同源基因，并进一步筛选，最终确定了 82 个具有海洋哺乳动物特异性趋同氨基酸替换的基因。这些基因在癌症抑制、脂质代谢、炎症反应和细胞周期调节等功能相关的基因本体（Gene Ontology，GO）术语中显著富集。例如，APPL1 基因中的 P378L 替换在鲸类、海牛和部分生活在寒冷环境中的鳍足类动物中趋同出现。功能分析发现，在 3T3-L1 小鼠前脂肪细胞系中过表达 APPL1^P378L变体，显著促进了脂质积累，关键脂肪生成标记物 PPARγ、CEBPα 和 FABP4 的表达也明显升高，这表明该替换有助于海洋哺乳动物厚脂肪层的发育。在癌症相关基因方面，27 个基因存在趋同进化，其中 NEIL1 基因的 E71G 替换在鲸类和鳍足类动物中出现。功能实验表明，携带该突变的小鼠细胞增殖速率显著降低，暗示其可能增强 DNA 修复效率，从而有助于海洋哺乳动物抵抗癌症。

非编码调控元件的趋同和谱系特异性变异也对海洋哺乳动物的进化产生了重要影响。研究人员通过比较 16 种鲸类、9 种鳍足类、1 种海牛目动物和 12 种陆地哺乳动物，利用 38 种全基因组比对，鉴定出 333,341 个哺乳动物保守非外显子元件（conserved non-exonic elements，CNEs），其中 1280 个在海洋哺乳动物中表现出替换速率的变化。这些海洋哺乳动物加速的 CNEs 在器官发育相关的 GO 术语中显著富集。在肢体发育相关的研究中，发现了 48 个靠近肢体发育基因的海洋哺乳动物特异性趋同加速 CNEs，如 NKX3-2、SOX9 和 HAND2 等基因附近。对其中 10 个 CNEs 进行体外双荧光素酶报告基因实验，8 个显示出与小鼠序列相比不同的调控活性，表明其功能发生了改变，可能影响肢体发育过程。此外，还发现了海洋哺乳动物谱系特异性的 CNE 缺失，如 CNE1402 中的 9-bp 缺失在鲸类和海牛中共享，该缺失可能增强了其顺式调控功能，对塑造海洋哺乳动物的肢体表型有重要作用。同时，研究还鉴定出了谱系特异性的基因组变异，如鲸类特异性的 CNE300 中的 12-bp 缺失，可能与鲸类后肢退化有关；鲸类特异性的 Hindlimb enhancer A（HLEA）中的 4 个缺失，影响了小鼠后肢的形态和基因表达，与海洋哺乳动物在二次水生适应过程中后肢的消失相关。

染色体的同线性断裂和三维基因组构象在海洋哺乳动物进化中同样扮演着重要角色。通过重建四种动物的高分辨率全基因组染色质相互作用图谱，研究发现海洋哺乳动物与陆地亲戚在染色质区室结构上存在差异，其 A 区室更短，基因分布更密集。在拓扑相关结构域（topologically associating domains，TADs）方面，虽然结构在四种基因组中大部分保守，但在鲸类和鳍足类动物中发现了独特的保守 TADs 和同线性断裂。例如，同线性断裂 6479 影响了脂质代谢相关基因的 TAD 结构，使 DNAJB3 和 MROH2A 基因的位置发生改变，可能影响脂质代谢调节，与海洋哺乳动物厚脂肪层的能量储存需求相关。此外，FAM43B 基因在海洋和陆地哺乳动物中的 TAD 定位不同，其在海洋哺乳动物中的染色质相互作用发生变化，可能影响基因的转录调控，进而与癌症抵抗等功能相关。

染色体结构变异（structural variations，SVs）对神经系统发育也有影响。研究鉴定出了鲸类特异性的 339 个 SVs 和鳍足类特异性的 1054 个 SVs，功能富集分析显示这些 SVs 与头部发育和神经元细胞形态发生及发育相关。例如，NUP153 和 ID4 等基因位于鲸类和鳍足类动物同源基因组区域的 SVs 中，且 ID4 基因附近的 SVs 靠近已知的人类前脑增强子，可能影响其表达和调控功能，为海洋哺乳动物独特的神经适应提供了遗传基础，有助于解释它们的高级认知和神经系统特征。

从研究结果来看，海洋哺乳动物在二次水生适应过程中，在多个层面发生了趋同进化。在脂肪层的进化上，APPL1 基因的氨基酸替换和相关基因组结构的改变，共同促进了脂质积累，使海洋哺乳动物能够更好地适应水生环境的温度挑战。在水生运动方面，非编码调控区域的变异，尤其是与肢体发育相关的 CNEs 的变化，推动了肢体形态的改变，如鲸类后肢的消失和鳍足类动物肢体演变成鳍状肢，优化了它们在水中的运动能力。在大脑和神经元发育方面，CNEs 的快速进化和 SVs 对神经元发育相关基因的影响，可能是海洋哺乳动物具有高级认知能力和复杂社会行为的遗传基础。在癌症抵抗方面，NEIL1 等癌症相关基因的趋同进化和染色质结构的改变，降低了海洋哺乳动物的癌症风险，为研究抗癌机制提供了新的视角。

不过，目前的研究也存在一些需要进一步探索的地方。虽然发现了许多与海洋哺乳动物二次水生适应趋同进化相关的分子机制，但仍有许多细节尚未完全明确。例如，在肢体发育中，CNEs 和其他调控元件如何精确调控基因表达，从而决定肢体的形态和结构；在神经系统发育方面，SVs 影响基因表达的具体分子途径还不清楚；在癌症抵抗机制上，还需要深入研究这些遗传变化如何协同作用，形成高效的抗癌防御系统。此外，研究主要集中在少数几种海洋哺乳动物和陆地亲戚上，未来需要扩大研究范围，涵盖更多的物种，以更全面地了解海洋哺乳动物的进化历程。

总体而言，这项研究通过多组学数据和功能实验，从编码区域、调控元件和基因组结构等多个层面，揭示了海洋哺乳动物二次水生适应趋同进化的分子机制，为我们理解生命在不同环境中的进化历程提供了宝贵的信息，也为后续相关领域的研究指明了方向。随着研究的不断深入，有望在海洋哺乳动物的进化、生物医学等多个领域取得更多的突破。