靶向长读长测序：提高常染色体显性多囊肾病（ADPKD）诊断率的新突破

时间：2025年3月12日

来源：npj Genomic Medicine

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研究针对 ADPKD 基因诊断难题，开展靶向长读长测序研究，提高诊断率，利于遗传咨询。

攻克多囊肾病诊断难题：长读长测序技术带来新曙光

在医学的神秘世界里，有一种疾病如同隐藏在肾脏里的 “定时炸弹”，它就是常染色体显性多囊肾病（Autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）。全球约有 0.1 - 0.25% 的人受其困扰，而且它还是导致终末期肾病的重要 “元凶” 之一，在这一病症的患者群体中，有 5 - 10% 是由 ADPKD 引发的。

临床诊断 ADPKD 通常依靠超声检查，但这种方法有局限性，对于 30 岁以下的年轻人，诊断结果常常不太准确。于是，分子基因检测成为确诊的关键。然而，ADPKD 的基因诊断堪称 “困难模式”。PKD1 基因不仅庞大，包含 46 个外显子，横跨 47.2kb 的基因组 DNA，而且它还有一段 39.9kb 的重复片段，与 6 个假基因相似度高达 98% ，这使得基因分析变得极为复杂。同时，PKD1 基因的外显子 1 富含 GC，难以用常规方法扩增和测序。此外，致病突变还存在高度的等位基因异质性，加上拷贝数变异（Copy number variants，CNVs）等因素，传统的基因检测方法，像短读长测序（Short-read sequencing，SRS）、多重连接依赖探针扩增技术（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等，都难以准确检测出所有类型的变异，导致部分患者无法得到明确诊断。

为了突破这些困境，山东大学附属生殖医学中心等机构的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在了《npj Genomic Medicine》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，从 2016 年 1 月至 2023 年 12 月，在山东大学附属生殖医学中心选取了 312 例临床诊断为 ADPKD 的患者，这些患者之前使用靶向 SRS 检测过。其中 272 例患者通过 SRS 检测到了致病或可能致病的单核苷酸变异（Single nucleotide variants，SNVs）/ 插入缺失（Insertions/Deletions，Indels），而剩下 40 例患者要么未确诊，要么确诊结果没有达到单核苷酸分辨率。对于这 40 例患者，研究人员运用靶向长读长测序（Long-read sequencing，LRS）技术对 PKD1 和 PKD2 基因进行分析。LRS 技术主要包括多重长距离 PCR 扩增基因组 DNA，构建 PacBio 单分子实时哑铃（SMRTbell）文库，然后在 Sequel IIe 平台上进行循环一致性测序（Circular consensus sequencing，CCS），最后通过自主开发的生物信息学流程分析数据。此外，还利用 Sanger 测序验证 LRS 与 SRS 检测结果不一致的 SNVs/Indels，用 MLPA 技术确认 LRS 新发现的 CNVs，对于可能影响 mRNA 剪接的变异，采用逆转录 PCR（RT-PCR）测序鉴定剪接位点。

研究取得了一系列重要成果：

诊断率显著提升：在 40 例之前未完全确诊的患者中，LRS 使遗传诊断率从 20.0%（8/40）提升到 45.0%（18/40），变异检测率从 62.5%（25/40）提升到 87.5%（35/40）。在所有 312 例患者中，遗传诊断率从 89.7%（280/312）提升到 92.8%（290/312），变异检测率从 95.2%（297/312）提升到 98.4%（307/312）。
精准检测多种变异：LRS 检测到 8 例 PKD1 基因的致病或可能致病的 SNVs/Indels，其中包括 4 例微基因转换、3 例 Indels 和 1 例深层内含子变异，这些变异都得到了 Sanger 测序的验证。例如，在 4 例微基因转换患者中，有 2 例携带相同的移码变异 PKD1_:c.160_166dup，SRS 未能检测到该变异。此外，LRS 还检测到 3 例小的插入缺失变异，这些变异因传统 SRS 读长或覆盖度问题而被遗漏。同时，LRS 发现了 2 个深层内含子变异，其中 PKD1_:c.2908 - 107G>A 通过 RT-PCR 和家系分析被证实可能致病。另外，LRS 还能对 SNVs/Indels 进行定相分析，确定变异在等位基因上的位置，这有助于了解疾病的遗传模式。
精确解析大片段变异：在检测 PKD1 基因的大片段缺失和重复方面，LRS 表现出色。它在 2 个样本中额外发现了 2 个大片段缺失，并精确确定了 8 个大片段缺失的断点。对于外显子 43 和 44 的重复，LRS 不仅确定了重复序列的具体信息，还明确了其插入位置，发现该重复导致了替代转录本的产生，使患者出现了特定的氨基酸插入。

研究结论表明，与传统的 SRS 相比，靶向 LRS 在 ADPKD 的基因诊断上具有显著优势。它能够检测出 SRS 遗漏的多种变异，包括微基因转换、特定大小的 Indels、深层内含子变异以及更准确地检测 CNVs 并确定其断点。这一成果对临床意义重大，能够为患者和家属提供更精准的遗传咨询，帮助他们在计划生育和对高危亲属进行基因检测时做出更明智的决策。对于接受辅助生殖的夫妇，还能通过植入前基因检测（Preimplantation genetic testing for monogenetic diseases，PGT-M）降低 ADPKD 遗传给下一代的风险。虽然目前 LRS 技术成本较高，但随着更具成本效益的仪器出现，未来它在临床应用中有望发挥更大的作用。这项研究为 ADPKD 的基因诊断开辟了新道路，也为其他遗传复杂疾病的研究提供了借鉴。