在口腔健康与全身健康紧密相连的当下，糖尿病和牙周炎的关联成为医学研究的热点。糖尿病作为一种常见的代谢性疾病，以慢性高血糖为特征，长期的代谢紊乱会引发多种并发症，其中牙周炎被视为糖尿病的第六大并发症。牙周炎是一种慢性口腔炎症性疾病，主要由宿主对细菌诱导的炎症免疫反应不足所致，会逐渐破坏牙周组织，严重时导致牙齿松动和脱落。对于糖尿病患者而言，其体内的高血糖环境会加剧牙周炎症，破坏牙周组织的修复能力，使得牙周炎的治疗更加困难。在临床治疗中，糖尿病牙周炎患者的治疗效果往往不尽人意，难以恢复牙周骨的稳态。
能量代谢在维持骨髓间充质干细胞（BMSCs）的功能和骨稳态中起着关键作用。BMSCs 作为成骨细胞的前体，对维持骨稳态至关重要。然而，在糖尿病牙周炎的高糖和炎症微环境下，BMSCs 的代谢特性以及其成骨分化功能受到怎样的影响，目前仍不清楚。丙酮酸激酶 M2（PKM2）作为糖酵解途径中的关键酶，不仅参与能量代谢过程，还在炎症反应等多种生理病理过程中发挥作用。但 PKM2 在高糖炎症条件下对 BMSCs 成骨分化的影响机制尚未明确。因此，探究 PKM2 在糖尿病牙周炎中对 BMSCs 的作用机制，对于寻找糖尿病牙周炎的有效治疗靶点具有重要意义。
为了解决上述问题，重庆医科大学的研究人员开展了 “PKM2 介导的代谢重编程在糖尿病牙周炎条件下 BMSCs 成骨分化中的作用” 这一研究。研究结果表明，PKM2 通过影响代谢和线粒体功能损害 BMSCs 的成骨能力，而紫草素作为 PKM2 的抑制剂，能够有效改善 BMSCs 的成骨功能，为糖尿病牙周炎的治疗提供了潜在的治疗靶点和新的治疗策略。该研究成果发表在《Stem Cell Research & Therapy》杂志上。
研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。细胞实验方面，采用间接共培养法，将 RAW264.7 细胞经高糖（35mmol/L）和 / 或脂多糖（1µg/mL）刺激后收集条件培养基（CM），用于培养 BMSCs。同时运用 CCK8、EdU、Annexin V-PI 凋亡检测、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红 S（ARS）染色等实验检测 BMSCs 的功能；通过 Seahorse 实验、乳酸生成、葡萄糖摄取和 ATP 测量评估细胞代谢特征；利用 JC-1、ROS 染色、Mito-Tracker 染色和透射电子显微镜（TEM）检测线粒体功能；借助定量实时 PCR 和蛋白质免疫印迹法分析基因和蛋白表达。动物实验方面，构建了 2 型糖尿病（T2DM）小鼠模型和实验性牙周炎模型，并进行分组给药，通过 micro-CT 和组织学染色评估药物治疗效果。
研究结果主要包括以下几个方面：
- CM-HG 加剧炎症微环境对 BMSCs 的损伤：研究人员利用间接共培养法模拟糖尿病牙周免疫微环境，发现高糖条件下制备的巨噬细胞条件培养基（CM-HG）在处理 BMSCs 5 天后，其活性相对降低；脂多糖条件下制备的巨噬细胞条件培养基（CM-LPS）处理后，BMSCs 活性在观察期内呈持续下降趋势；而高糖和脂多糖共同处理制备的巨噬细胞条件培养基（CM-HG + LPS）显著降低了 BMSCs 的活力和增殖能力，同时增加了细胞凋亡率。此外，CM-HG + LPS 处理还显著降低了 BMSCs 的成骨分化潜力，在基因和蛋白水平也验证了这一结果。
- CM-HG + LPS 处理诱导细胞代谢重编程：研究人员通过 Seahorse 实验等方法研究 BMSCs 的代谢特征，发现早期（成骨诱导 3 天）各处理组间氧化磷酸化率无显著变化，但糖酵解和糖酵解能力显著增加；后期（成骨诱导 7 天），CM-LPS 处理组和对照组的细胞氧消耗率（OCR）出现显著差异，CM-HG + LPS 处理组的基础 OCR、FCCP 诱导的最大 OCR 和 ATP 相关 OCR 降低，细胞外酸化率（ECAR）差异更明显，糖酵解和糖酵解能力增强，但总 ATP 生成减少。这表明 BMSCs 在 CM-HG 或 / 和 CM-LPS 处理后发生代谢重编程，从依赖氧化磷酸化（OXPHOS）转变为糖酵解，且能量消耗增加但 ATP 合成受阻。
- PKM2 四聚体可能介导 HG 炎症微环境下细胞的糖酵解：研究人员通过定量实时 PCR 和蛋白质免疫印迹法检测发现，CM-HG + LPS 处理上调了糖酵解途径中关键酶 LDHA、PFKFB3 和 PKM2 的水平，其中 PKM2 表达显著增加。DSS 交联实验表明，CM-HG + LPS 处理显著诱导 PKM2 四聚体表达，免疫荧光染色也证实了这一结果。
- CM-HG + LPS 处理损害线粒体功能并改变线粒体形态：研究人员通过检测线粒体膜电位（MMP）、细胞内活性氧（ROS）水平、线粒体形态和线粒体动力学相关基因和蛋白表达，发现 CM-HG 和 CM-LPS 处理均降低 MMP、增加 ROS 水平，CM-HG + LPS 处理对线粒体功能的破坏最为显著。Mito-Tracker 染色和 TEM 结果显示，各处理组线粒体网络结构均被破坏和碎片化，CM-HG + LPS 组最为明显。此外，CM-HG + LPS 处理还导致线粒体融合相关蛋白 MFN2 和 OPA1 表达减少，线粒体分裂相关蛋白 FIS1 和 DRP1 表达增加。
- 抑制 PKM2 促进 HG 炎症条件下 BMSCs 线粒体融合，改善线粒体功能：研究人员以紫草素作为 PKM2 抑制剂进行实验，发现紫草素单独处理可在一定程度上促进线粒体伸长，改善 CM-HG + LPS 诱导的线粒体碎片化。TEM 结果也支持这一发现，同时紫草素处理还增加了 MFN2 和 OPA1 水平，降低了 DRP1 和 FIS1 表达，缓解了 CM-HG + LPS 组 MMP 的变化，减少了 ROS 生成。
- 紫草素主要通过抑制 PKM2 四聚体形成逆转细胞代谢重编程：研究人员评估了紫草素处理后细胞的代谢特征，发现紫草素缓解了 CM-HG + LPS 对 OCR 的抑制，适度增强了细胞的基础呼吸、最大呼吸和 ATP 相关呼吸；降低了细胞过高的糖酵解和糖酵解能力，增加了糖酵解储备；抑制了糖酵解终产物乳酸的释放，减少了应激细胞的葡萄糖摄取，提高了总 ATP 水平。此外，紫草素还显著降低了 LDHA、PFKFB3 和 PKM2 的表达，抑制了 PKM2 四聚体的表达。
- 紫草素通过激活 AMPK 通路减轻 HG 炎症条件下对 BMSCs 成骨功能的抑制：研究人员通过 ALP 和 ARS 染色、定量 PCR 和蛋白质免疫印迹法等实验发现，紫草素对细胞具有治疗作用，在正常和 HG 炎症条件下均能促进 BMSCs 成骨。由于 AMP 激活蛋白激酶（AMPK）是细胞代谢和能量平衡的关键调节因子，且与 PKM2 密切相关，研究人员推测紫草素通过激活 AMPK 通路减轻对 BMSCs 成骨功能的抑制。后续实验验证了这一观点，添加 AMPK 激活剂二甲双胍可挽救 BMSCs 的成骨功能，而抑制剂 dorsomorphin 则削弱了紫草素对 AMPK 的激活作用，逆转了其对 BMSCs 成骨分化的促进作用。
- 紫草素减少糖尿病牙周炎小鼠牙槽骨丢失，促进牙周组织重塑：研究人员通过体内实验评估紫草素的治疗效果，成功建立了 T2DM 小鼠模型和实验性牙周炎模型。Micro-CT 和组织学分析结果表明，紫草素治疗显著减少了糖尿病牙周炎小鼠的牙槽骨丢失，增加了骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）；HE 染色、Masson 染色和 TRAP 染色结果显示，紫草素改善了牙周组织的炎症和结构，减少了破骨细胞数量；免疫组化和免疫荧光染色结果表明，紫草素增加了成骨相关蛋白 RUNX2 的表达，抑制了 PKM2 的表达，促进了牙周组织的成骨。
综上所述，该研究深入探讨了高糖炎症微环境对 BMSCs 功能的破坏作用，以及 PKM2 异常上调介导的代谢和线粒体动力学变化。研究发现紫草素作为 PKM2 抑制剂，能够有效挽救 BMSCs 的成骨功能，为糖尿病牙周炎的骨再生治疗提供了一种有前景的方法。然而，该研究仍存在一些局限性，如破骨细胞在高糖炎症环境中的作用机制尚未充分探索。未来的研究可以进一步关注破骨细胞代谢以及紫草素对其的治疗效果，从更全面的角度验证该治疗策略的有效性，为糖尿病牙周炎的临床治疗提供更坚实的理论基础和实践指导。
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