单细胞转录组分析揭示人体血液组织中 iNKT 细胞的多样性：解锁免疫治疗新密码

时间：2025年4月30日

来源：Cell Reports

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这篇研究通过单细胞转录组分析，全面解析了人体外周血、脐带血、胸腺和骨髓中不变自然杀伤 T（iNKT）细胞的转录组多样性。研究发现多种转录特征，为理解 iNKT 细胞异质性提供依据，助力基于 iNKT 细胞的细胞治疗开发。

研究背景

不变自然杀伤 T（iNKT）细胞处于固有免疫和适应性免疫的交界，在抵御病原体、监测恶性细胞方面发挥着重要保护作用。iNKT 细胞通过其不变的 T 细胞受体（TCR；人类为 Vα24Jα18/Vβ11 ，小鼠为 Vα14Jα18 与 Vβ2、 -7 或 -8）识别由主要组织相容性复合体（MHC）样蛋白 CD1d 呈递的糖脂抗原。由于 CD1d 的单态性，iNKT 细胞不会引发移植物抗宿主病（GVHD），这使其成为通用供体细胞治疗的有力平台，目前相关的临床试验正在开展。

在小鼠研究中，iNKT 细胞的发育被描述为沿着 0 - 3 阶段线性进行。0 阶段（ST0）细胞（CD24⁺CD44⁻NK1.1⁻）是胸腺中最早可检测到的 iNKT 细胞，随后逐渐丢失 CD24（ST1）、表达 CD44（ST2），最成熟的 ST3 细胞表达 NK1.1，且胸腺迁出主要发生在 ST2 阶段。此外，小鼠 iNKT 细胞存在功能不同的亚群，类似辅助性 T（Th）细胞亚群，如 Th1 样的 iNKT1 细胞、Th2 样的 iNKT2 细胞和 Th17 样的 iNKT17 细胞。然而，对于人类 iNKT 细胞亚群的全面了解仍然有限，缺乏对其异质性的综合研究。

研究目的

本研究旨在定义来自外周血（PB）、脐带血（CB）、骨髓（BM）和胸腺的人类 iNKT 细胞的转录组异质性，研究未刺激状态下人类 iNKT 细胞的异质性，以更好地理解其亚群，为基于 iNKT 细胞的细胞治疗开发提供关键信息。

研究方法

样本采集与处理：研究使用的样本包括来自斯坦福血液中心、Our Blood Institute、Oklahoma、ImpactLife 的人类血液，斯坦福大学 Binns Program 的人类脐带血，斯坦福大学医学院的人类胸腺组织和骨髓。样本采集后，通过机械解离、密度梯度离心等方法处理，获得单核细胞，并进行冷冻保存或直接用于后续实验。
iNKT 细胞富集与分选：利用磁珠富集和荧光激活细胞分选（FACS）技术，富集 iNKT 细胞。具体操作是先通过磁珠阳性选择富集 iNKT 细胞，再用荧光标记抗体染色，分选活的、单阳性的 CD19⁻CD14⁻CD24⁻CD3⁺Vα24⁺Vβ11⁺细胞。
单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）：使用 BD Rhapsody mRNA 和 AbSeq 试剂试剂盒进行细胞捕获和文库制备，然后在 NovaSeq6000 上进行测序。数据处理使用 BD Rhapsody 管道，后续分析在 R 语言环境中进行。
数据分析方法：运用 Seurat、Monocle3、SCENIC 等软件和算法，对 scRNA - seq 数据进行预处理、聚类分析、轨迹重建、转录因子调控分析等。同时，通过整合外部数据集，比较小鼠和人类 iNKT 细胞的转录组特征。

研究结果

人类 iNKT 细胞景观的单细胞分辨率调查：对人类 iNKT 细胞的转录组异质性进行研究，在多血液组织实验中对 11,039 个细胞进行全转录组分析，在仅外周血实验中对 24,758 个细胞进行靶向测序。分析结果显示，人类 iNKT 细胞存在 8 个聚类，不同组织来源的 iNKT 细胞在各聚类中的分布不同，但外周血来源的 iNKT 细胞在所有聚类中均有大量检测到。
人类 iNKT 细胞中 TBX21 和 RORC 的表达模式：与小鼠不同，人类 iNKT 细胞中存在同时表达 RORC 和 TBX21 的聚类，如 C2 和 C5，这些细胞表现出 Th1/17 样特征，且在人外周血中也通过流式细胞术检测到 Tbet⁺RORγt⁺的 iNKT 细胞。此外，根据转录因子的表达模式，人类 iNKT 细胞可分为早期前体、过渡和 Th1/17 样细胞。
分子表达特征暗示 iNKT 细胞聚类间的不同效应功能：Th1/17 样的 C2 和 C5 聚类中，与细胞毒性和其他 NK 细胞功能相关的基因表达显著增加，如 GZMK、KLRG1、GZMA 等，这些聚类可被描述为 Th1/17/NK 样。同时，不同聚类的细胞因子受体表达不同，表明它们对细胞因子的反应功能不同，过渡聚类 C0、C3 和 C6 可能具有一些 Th2 样特征。
调控分析揭示人类 iNKT 细胞亚群中活跃的转录因子：通过 SCENIC 进行调控分析，发现不同聚类的 iNKT 细胞中存在不同活跃的转录因子。例如，C1 和 C7 中 SOX4 调控子高表达，与小鼠早期 iNKT 细胞发育相关；C0 中 YY1 调控子活性增加，暗示该过渡群体具有 Th2 样特征。此外，通过细胞轨迹重建分析，进一步明确了 iNKT 细胞的分化轨迹和相关转录因子的变化。
表达模式揭示独特的 T_EM CD45RA⁺样 iNKT 细胞：根据 CD45RA、CD45RO、CCR7 和 SELL 的表达，发现前体聚类（C1、C4 和 C7）具有幼稚 / 前体特征，而大部分其他 iNKT 细胞显示 T_EM特征。令人惊讶的是，C5 聚类中的一个亚群（C5.1）主要表达 CD45RA 且 CCR7 转录本缺失，类似 T 效应记忆 RA⁺（TEMRA）细胞，且在人外周血中通过流式细胞术检测到该细胞群。
CD4 和 CD8 表达揭示 CD8⁺ iNKT 细胞的幼稚 / 前体转录谱：利用寡聚体结合抗体分析 CD4 和 CD8 蛋白表达，发现 CD8⁺ iNKT 细胞（C7）具有幼稚 / 前体转录谱。此外，CD4 的表达并不能很好地划分 iNKT 细胞的功能亚群，Th1/17/NK 样群体中也存在 CD4⁺细胞。
人类 PB 来源的 iNKT 细胞的转录分析揭示进一步的异质性：对 PB 来源的 iNKT 细胞进行靶向 scRNA - seq 分析，再次鉴定出幼稚 / 前体、过渡和 Th1/17/NK 样聚类。同时，发现两个 CD8⁺ iNKT 细胞聚类，分别具有幼稚 / 前体和 Th1/17/NK 样转录模式，且大部分 PB 来源的 CD8⁺ iNKT 细胞表达 CD8αα 同二聚体。
iNKT 细胞中不同血液组织的不同生物学过程：利用非负矩阵分解（NMF）评估不同血液组织中 iNKT 细胞的转录差异，发现不同组织来源的 iNKT 细胞在一些生物学过程上存在差异。例如，PB 和 BM 来源的 Th1/17/NK 样聚类虽有共同特征，但也包含不同的生物学基因程序。

研究结论

iNKT 细胞的分化轨迹和特征：人类 iNKT 细胞形成分化轨迹，起源于早期前体阶段，表达与小鼠 iNKT 细胞发育相关的基因。大部分 iNKT 细胞表达 T_EM谱，少数 DN iNKT 细胞显示 TEMRA 样表达模式。转录因子网络在 iNKT 细胞分化过程中发生变化，影响其分化状态。
与小鼠 iNKT 细胞的差异：与小鼠不同，人类 iNKT 细胞存在 Th1/17 样细胞，其特征为 TBX21 和 RORC 的共表达。此外，人类 CD8⁺ iNKT 细胞具有不同的转录模式，CD4 和 CD8 的表达不能清晰划分 iNKT 细胞的功能亚群。
研究的意义和局限性：本研究为未来研究 iNKT 细胞在不同疾病状态、免疫环境和体外扩增中的差异功能提供了资源，有助于优化基于 iNKT 细胞的细胞治疗开发。然而，研究存在一些局限性，如无法分析匹配样本、不能确定性别和年龄对结果的影响、未分析 II 型 NKT 细胞和罕见非典型 I 型 NKT 细胞，且需要对转录特征及其功能影响进行验证。