在人体的内分泌调节网络中，皮质醇和它的主要代谢产物可的松，就像两位 “关键管家”，通过下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴（HPAA）调节着身体对压力的反应，维持着体内环境的稳定。一旦这两位 “管家” 的工作出现异常，各种肾上腺疾病，如库欣综合征（Cushing’s syndrome）、艾迪生病（Addison’s disease）和肾上腺功能不全（adrenal insufficiency）等就可能找上门来。
长期以来，传统的免疫分析法是检测皮质醇、可的松及其代谢物的常用手段。但这种方法就像一位容易被干扰的 “粗心侦探”，会受到结构相似化合物的影响，产生交叉反应，导致检测结果不准确。这一问题在诊断肾上腺疾病时，可能会让医生做出错误的判断，延误患者的治疗。
为了攻克这一难题，来自都灵大学（University of Turin）的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们开发了一种 “稀释进样” 液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）法，用于快速、准确地分析尿中游离皮质醇、可的松及其完整的 Ⅱ 相代谢物（如葡糖醛酸结合物和硫酸结合物）。该研究成果发表在《Clinica Chimica Acta》杂志上，为肾上腺疾病的诊断和研究开辟了新的道路。
研究人员在开展这项研究时，用到了几个关键技术方法。首先是样本处理技术，他们将尿液样本与含同位素标记内标的甲醇 / 水混合，经涡旋、离心后取上清液进样分析。其次是仪器分析技术，使用 Nexera X2 UHPLC 系统和 Citrine Triple Quad MS/MS 系统，在特定的色谱和质谱条件下对样本进行检测。此外，还通过分析 79 例 24 小时尿样，与临床实验室常用的 LC-MS/MS 法对比，评估新方法性能，并将新方法应用于 168 例肾上腺疾病患者的真实尿样检测。
下面来看具体的研究结果：
- 方法验证：通过一系列实验对新方法进行验证。在校准方面，根据 Levene's 检验和 Mandel 检验结果，确定了各分析物的校准模型，部分为线性模型，部分为二次模型。准确度和精密度评估显示，日内和日间的偏差百分比和变异系数（CV%）大多低于 15%，表明该方法可靠性高。通过 Hubaux-Vos 算法结合实验确定了检测限（LOD）和定量限（LLOQ），所有分析物的 LLOQ 为 1 ng/mL。基质效应评估发现，合成尿液适合制备校准和验证样本，且所有分析物的基质效应均较低。此外，该方法选择性良好，几乎不存在携带污染，样本在 4°C 至少可稳定保存 7 天，经多次冻融循环和长期储存后也具有较好的稳定性。
- 方法比较：将新方法与常规 LC-MS/MS 法进行比较，Passing-Bablok 回归和 Bland-Altman 图分析结果显示，两种方法在测量尿中皮质醇和可的松浓度时具有良好的相关性，虽在低浓度区域差异较大，但偏差不显著，说明新方法在这两种分析物的检测上可达到与常规方法相似的性能。
- 临床应用：对 168 例不同肾上腺疾病患者（包括肾上腺皮质癌（ACC）、原发性醛固酮增多症（PA）、轻度自主性皮质醇分泌（MACS）、非功能性肾上腺偶发瘤（NFAI）和嗜铬细胞瘤（PHEO））的 24 小时尿样分析发现，皮质醇、可的松和皮质醇 - 21 - 葡糖醛酸在不同病理类别间的排泄量无显著差异，但硫酸结合代谢物存在显著差异。进一步分析表明，MACS 患者的硫酸化类固醇排泄量较高，且在与其他疾病类别的比较中，MACS 与 PA、NFAI、PHEO 在硫酸结合代谢物排泄量上存在显著差异，这有助于区分不同的肾上腺疾病。
综合研究结果，研究人员得出结论：新开发的 “稀释进样” LC-MS/MS 法在尿样中皮质醇、可的松及其 Ⅱ 相代谢物的检测上表现出色，具有高准确度、精密度、特异性和灵敏度，且分析速度快，色谱运行时间仅 9 分钟。该方法减少了传统样本前处理步骤，更适用于临床化学实验室的自动化操作。同时，监测 Ⅱ 相代谢物，尤其是硫酸结合物，能为临床诊断提供更具体的信息，有助于更快地诊断肾上腺疾病。不过，研究也存在一些局限性，比如需要为结合型类固醇找到更合适的同位素内标，且对于 ACC 患者的研究结论还需扩大样本量进一步确认。但总体而言，这项研究为肾上腺疾病的诊断和研究提供了新的有力工具，有望推动该领域的进一步发展。
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