大脑皮质掌控着从感觉运动到情感等复杂行为，其细胞类型多样且呈分层结构。在神经发育过程中，神经管闭合后，Wingless/int-1（WNT）、骨形态发生蛋白（BMP）和音猬因子（SHH）等形态发生素确定大脑区域化和神经发生的初始轴线。小鼠胚胎 9 天（E9）时，神经上皮细胞分化为放射状胶质细胞，标志着皮质神经发生开始。放射状胶质细胞通过不对称分裂产生新神经元，并为其迁移提供支架。在胚胎 17 天（E17）前，大脑皮层的大部分投射神经元由大脑半球的放射状胶质细胞产生；而中间神经元则从胚胎 13 天（E13）开始由大脑半球下的区域产生，并迁移到大脑半球。胚胎 18 天（E18）后，放射状胶质细胞开始产生或转变为神经胶质细胞，如星形胶质细胞和少突胶质细胞。

经典遗传学研究发现了多个对皮质发生至关重要的转录因子（TFs）。近年来，基于 CRISPR 的基因编辑、单细胞基因组学和体内靶向大脑的病毒策略等分子技术的发展，让我们对 TFs 在皮质发生中细胞类型特异性作用、相互网络关系以及在细胞类型形成和维持中的关键时间点有了更深入的了解。虽然空间组学工具在皮质发育研究中也很重要，但由于篇幅限制，本文不做讨论。

细胞类型特异性 TFs 是细胞类型定型过程中的关键分子，很大程度上决定了细胞的形态、位置和功能。在整个皮质神经发生过程中，一些 TFs 在特定细胞类型中表达，如 Tbr1 在第 6 层投射神经元中、Fezf2 在第 5 层锥体束投射（PT）神经元和脑内投射（IT）神经元中、Dlx1/Dlx2 在大脑半球下的皮质中间神经元中。

通过敲除转基因小鼠模型研究发现，TFs 对皮质神经发生的多个方面至关重要，如区域和分层命运决定。例如，Pax6 - Tbr2 - Tbr1 在大脑半球的表达模式对分层命运决定至关重要。Tbr1 敲除后，额叶皮质身份会转变为尾侧，且第 6 层投射神经元身份维持需要 Tbr1 。敲除 Tbr1 后，第 6 层投射神经元的相关基因特征改变，还获得了第 5 层神经元的独特电生理特性。

除 Tbr1 外，Fezf2、Foxg1 和 Satb2 等 TFs 也通过敲除小鼠研究被发现参与调节分层命运，且它们之间相互作用和调控。这些研究表明皮质分层命运可能由 TFs 网络编程，同时也存在如终端选择基因决定细胞命运的假说，Fezf2 可能就是定义皮质脊髓运动神经元的终端选择基因。不过，仍需要高通量方法来全面描绘这一动态过程。

为实现高通量研究，从批量 RNA 测序转向单细胞基因组分析是关键一步。批量 RNA 测序在特定条件下可分析特定细胞类型，但为每种细胞类型构建转基因动物或探针既复杂又低效。单细胞基因组分析则可直接测量单个细胞的 RNA，以表征细胞类型的异质性。

过去几十年，技术发展使单细胞分析取得巨大进步，从微阵列技术到下一代测序，检测灵敏度提高；通过用独特 DNA 序列标记细胞，通量也得以提升。基于液滴或微孔的单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）技术使分析的细胞数量从几百个增加到数万个。虽然批量 RNA 测序更具成本效益，但 scRNA - seq 在解析细胞类型特异性表达、揭示细胞类型异质性以及进行细胞轨迹和谱系分析等方面具有明显优势。

多个研究小组应用 scRNA - seq 对发育中的小鼠皮质细胞类型及其基因表达模式进行分类，构建了发育中小鼠体感皮质、大脑皮质和整个胚胎脑的单细胞转录图谱，这些数据集高分辨率展示了皮质发生过程中的细胞组成和 TF 调控网络动态变化。

研究发现，在全脑水平上，神经发生向神经胶质发生的转变发生在 E12 - E16 ；新皮质顶端祖细胞在 E13 开始分化为神经元和神经胶质分支，且神经元分支祖细胞富含神经发生标记物，神经胶质分支则富含放射状胶质细胞标记物和增殖相关基因。在神经元分支中，祖细胞群体形成按年龄排序的分化连续体，而非离散亚型。同时，已知的胼胝体神经元和皮质传出神经元标记物虽在祖细胞中广泛表达，但并不决定细胞类型聚类。这些表明皮质祖细胞可在逐渐改变分子特征的同时，沿连续体维持其潜能。

这一模型得到其他研究的证实。此外，一些研究通过 DNA 条形码追踪细胞谱系，发现早期标记的祖细胞产生的克隆分化为不同细胞类型的比例更高，且随着时间推移祖细胞的潜能降低。还有研究通过特定策略标记不同时间的祖细胞，分析其转录组变化，发现早期和晚期标记的祖细胞表达不同的基因程序。

RNA 分析还可与染色质可及性、DNA 甲基化和三维基因组结构等数据整合，构建皮质发育的整体调控景观。通过单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC - seq）等技术，研究人员发现祖细胞在分化过程中保留共同分子身份，同时也明确了 TFs 在细胞命运决定过程中对染色质景观重组的关键作用，如 Neurog2 在调节增强子活性、DNA 甲基化和染色质可及性方面的新作用。

然而，目前系统研究分子作用对大脑发育因果影响的能力仍有限，传统构建单个基因敲除模型的方法难以扩展，这促使了功能基因组技术的发展。

CRISPR - Cas9 基因编辑技术的发展使得体内快速高效构建基因敲除模型成为可能。基于此，多个团队开发了 Perturb - seq 或 CROP - seq 等技术，将多重基因编辑与单细胞转录组表型分析相结合，实现高通量、高内涵的遗传筛选。

Jin 团队开发的体内 Perturb - seq 技术，可在体内单细胞水平对多个基因进行研究和基因型 - 表型映射，将体内功能遗传学的表型测量单位从动物缩小到细胞。他们应用该技术研究了 35 个与自闭症谱系障碍相关的新生风险基因，相比传统逐个构建转基因动物模型，大大节省了时间和成本。通过结合可扩展的基因扰动和高分辨率 scRNA - seq 读数，明确了受风险基因影响的细胞类型和基因程序，有助于分层分析基因型 - 表型异质性。

这一方法还被用于研究 Meis2 对侧脑室隆起（LGE）来源的 GABA 能投射神经元（PNs）谱系选择和激活的作用。研究人员设计了一种基于转座酶的整合盒，可表达 gRNAs 和克隆 DNA 条形码，通过电穿孔将质粒导入胚胎，对扰动细胞进行 scRNA - seq 分析，确定了受 Meis2 敲除影响最大的 PN 簇，并通过克隆追踪分析证实了 Meis2 扰动导致有丝分裂后产生的细胞从 PN 向中间神经元（IN）转变，验证了体内 Pooled CRISPR 筛选策略的可行性和有效性。

将 Perturb - seq 应用于体内研究面临着从完整组织中标记细胞有限的挑战。与慢病毒相比，腺相关病毒（AAV）具有更高的组织穿透性和标记效率。两项最新研究分别采用 AAV 进行 Perturb - seq 实验。

Santinha 团队使用静脉注射的 AAV9 - PHP.B 血清型，分析了 22q11.2 缺失综合征相关的 29 个基因在注射 4 周后对 6 种皮质细胞类型的扰动效应。Zheng 团队鉴定出一种针对新生神经元的快速作用血清型 AAV - SCH9，并利用 piggyBac 转座子在胚胎脑中引入可遗传和持续的 gRNA 表达，提高基因编辑效率。他们通过测试不同 AAV 剂量优化转导率，将针对 Foxg1 和 Tbr1 等四个 TFs 的 gRNA 文库导入胚胎 14 天（E14）的侧脑室，对多种细胞类型进行标记和扰动。

对出生后 7 天（P7）的大脑进行转录组分析发现，Tbr1 扰动对第 5 层和第 6 层投射神经元影响显著，导致第 6 层 - CT 投射神经元中 Fezf2（第 5 层标记）上调，Neurod1 和 Neurod2（第 6 层标记）下调。Foxg1 扰动则引起细胞类型特异性的分层特征变化，在第 6 层 CT 神经元中出现混合细胞亚群，且通过差异基因表达分析发现其影响了黏附和突触分子的调节，还导致一些 TFs 异位表达。这些结果表明基于 AAV 的体内 Perturb - seq 能够检测不同细胞类型的全基因组分子表型，解析 TFs 在皮质发生中的功能。

Perturb - seq 不仅可用于研究小鼠皮质神经发生，还可探索人类皮质神经发生的潜在机制。人类大脑皮质发生持续约 4 个月，虽神经元数量远多于小鼠，但具有相似的多层结构。体外三维脑类器官可由人类多能干细胞诱导形成，能模拟人类产前大脑的分层神经元组织和转录组、表观基因组特征。

Fleck 团队构建了人类脑类器官发育的多组学图谱，扰动 20 个 TFs 后发现 GLI3 对背腹神经元命运特化至关重要。Esk 团队通过 CRISPR 筛选扰动 172 个与小头畸形相关的风险基因，发现 32 个基因的 gRNAs 显著减少，表明这些基因促进细胞增殖。Li 团队对 36 个自闭症谱系障碍风险基因进行人类脑类器官筛选，确定了产前发育中对这些风险基因特别敏感的细胞类型，并分析了差异表达基因的共享下游效应。

随着体内遗传筛选技术的不断改进和拓展，其应用前景将更加广阔。目前，体内筛选的通量受细胞标记和从活组织中获取细胞效率的限制，用 AAV 替代传统慢病毒载体已取得一定进展，未来病毒工程有望进一步提高检测通量，实现跨组织类型的体内全基因组筛选。

当前体内 Perturb - seq 主要依赖 scRNA - seq 作为读数，组织解离会导致非细胞自主表型丢失。未来技术发展应整合更多读数，如空间转录组学，同时结合基因组学、表观基因组学（染色质可及性、DNA 甲基组、三维基因组结构等）和细胞水平（形态学、电生理学等）的多组学读数，全面研究基因型 - 表型关系。

优化体内扰动效应也非常重要，使用多个 gRNAs 可提高编辑效率。此外，还可在病毒嗜性、转基因表达起始时间和基因编辑起始时间等方面进行优化，精准控制遗传扰动的时间和位置。除了 CRISPR 基因敲除筛选，整合 CRISPR 激活（CRISPRa）、CRISPR 干扰（CRISPRi）和引导编辑等其他遗传干预方式，能够在基因的不同功能状态下进行表型分析。同时，表观遗传操作方法可用于研究非编码调控元件，构建编码和非编码基因组调控机制的综合景观。通过多重扰动同时靶向多个基因，Perturb - seq 有望在剖析神经发育中的基因调控网络方面发挥更大作用。

解析多种脑细胞的生成、成熟过程及其遗传易感性，是理解大脑复杂性和脑部疾病易感性的关键。单细胞多模态分析和体内 Perturb - seq 等技术的发展，为实现这一目标提供了有力支持。随着实验可分析细胞数量增加、成本降低以及扰动靶向能力的提升，相关研究将加速推进。新兴的基因组和成像工具将为研究增添新维度，Perturb - seq 和功能基因组学产生的新假设可通过更多模型和实验进一步验证。未来，整合细胞形态学、电生理学、钙成像和神经元连接分析等多种方法，将为全面理解大脑分子机制带来前所未有的机遇，尤其在应用于更多脑区和跨物种研究时，有望拓展我们对大脑发育遗传机制的认识。