摘要2 O2 诱导的TM3细胞模型。
本文发表于《Journal of Ethnopharmacology》，围绕雄蚕益肾方（XCYSF）治疗迟发性性腺功能减退症（LOH）的药效物质基础及分子机制展开研究。LOH是中老年男性常见的临床综合征，以年龄相关的睾酮下降为主要特征，常伴随性欲减退、勃起功能障碍等症状，并进一步影响体力状态、糖脂代谢、骨代谢、心血管健康及心理健康。现代医学主要采用睾酮替代治疗（TRT），但其潜在安全性问题仍然存在，包括前列腺癌、乳腺癌以及心脑血管事件风险增加等。因此，探索更安全、有效的替代干预策略具有重要现实意义。传统中医药在改善LOH临床症状方面显示出一定优势，XCYSF作为由雄蚕蛾、淫羊藿、熟地黄、枸杞子、白芍、蒺藜组成的复方，来源于经典方药理论，既往临床及实验研究已提示其可改善LOH患者症状并提高睾酮水平，但其入血活性成分及系统作用机制尚未完全阐明，这构成了本研究开展的直接原因。
为揭示XCYSF治疗LOH的物质基础与作用通路，研究人员构建了基于血清药物化学、网络药理学与代谢组学相结合的综合研究策略。研究首先从体内入血成分出发，结合疾病相关靶点与代谢异常谱，筛选核心作用网络，继而通过体内外实验验证关键通路与靶点，从而在“成分—靶点—代谢—功能”层面系统解析XCYSF的作用机制。研究结果显示，XCYSF治疗LOH的关键机制与PI3K/Akt/mTOR信号通路密切相关，并可能通过调控Leydig细胞（睾丸间质细胞）的睾酮合成功能发挥作用。其中，刺蒺藜苷（tribuloside）被鉴定为潜在关键活性成分之一。总体而言，研究证实XCYSF可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进睾酮合成并改善LOH表型，为中药复方治疗LOH提供了实验依据和机制支撑。
方法概括：研究人员采用UPLC-Q-TOF-MS对XCYSF大鼠血清入血成分进行鉴定；基于入血成分靶点与LOH疾病靶点开展网络药理学分析；在环磷酰胺诱导的LOH大鼠血清样本中实施代谢组学分析以筛选差异代谢物及通路；通过分子对接验证核心成分与靶点结合潜力；并结合LOH大鼠模型与H
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2 诱导TM3细胞模型，应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质印迹法（WB）和免疫荧光（IF）对核心机制进行验证。
以下结合文中结果部分的小标题进行归纳解读。
XCYSF restored testosterone levels and improved testicular histomorphology in LOH rats
研究人员首先在环磷酰胺诱导的LOH大鼠模型中评价XCYSF的整体干预效应。结果显示，造模后大鼠体重及血清睾酮水平均显著下降，提示LOH模型构建成功。XCYSF干预后，大鼠睾酮水平得到恢复，同时睾丸组织形态学损伤出现改善。该结果表明XCYSF对LOH具有明确的体内治疗效应，且其作用不仅体现在激素水平恢复，也涉及睾丸组织结构与功能状态的改善，为后续物质基础和机制分析提供了药效学依据。
Identification of absorbed components of XCYSF in rat serum
围绕中药复方“何种成分真正进入体内并发挥作用”这一核心问题，研究人员采用UPLC-Q-TOF-MS对XCYSF给药后大鼠血清进行分析，鉴定出31种入血成分。这一结果对于明确XCYSF的药效物质基础具有关键意义。与基于体外化学成分的推测不同，入血成分更能反映真实的体内暴露状态和潜在生物活性，因此本研究以这些成分作为后续网络药理学分析的起点，提高了机制预测的可信度和针对性。
Network pharmacology analysis of absorbed components against LOH
在明确31种入血成分后，研究人员运用网络药理学方法，整合成分潜在靶点与LOH疾病相关靶点，筛选出255个与LOH相关的潜在作用靶点。通过该分析，研究初步构建了XCYSF干预LOH的多成分、多靶点作用网络，提示该复方并非通过单一通路发挥作用，而是通过多层级分子网络实现整体调控。进一步分析聚焦于AR、mTOR、GSK3β和APP等核心靶点，并为后续与代谢组学结果的整合提供了方向。
Metabolomics analysis revealed metabolic disturbances associated with LOH and XCYSF intervention
研究人员进一步对LOH大鼠血清进行代谢组学分析，鉴定出48种差异代谢物。通路富集结果提示，这些差异代谢物主要涉及甘油磷脂代谢、胆汁酸代谢及自噬相关过程。该结果说明LOH状态下存在较为显著的脂质代谢紊乱和细胞稳态调控异常，而XCYSF可能通过纠正这些代谢异常发挥治疗效应。代谢组学层面的发现为理解LOH的病理基础提供了生化证据，同时也从系统生物学角度支持XCYSF对机体代谢网络的整体调节作用。
Integrated analysis of network pharmacology and metabolomics
在网络药理学与代谢组学整合分析中，研究人员将入血成分、核心靶点和异常代谢通路进行关联，最终将研究重点集中于PI3K/Akt/mTOR信号通路。该通路在细胞生长、代谢调控、自噬和生存维持中具有重要作用，其异常激活或失衡可能影响Leydig细胞功能及睾酮合成。整合分析不仅实现了从“成分—靶点”到“代谢—通路”的跨层级联结，也使研究结论具有更强的系统性。核心靶点AR、mTOR、GSK3β和APP的提出，为后续实验验证建立了明确坐标。
Molecular docking validated interactions between key components and core targets
为验证预测成分与核心靶点之间的结合可能性，研究人员进行了分子对接分析。结果支持关键活性成分与核心靶点之间存在较好的结合潜力，从计算层面增强了“XCYSF入血成分可直接作用于相关分子靶点”的证据链。分子对接虽然不能替代功能实验，但其与网络药理学和后续体内外验证结果相互印证，提升了整体机制推断的可靠性。
XCYSF inhibited the PI3K/Akt/mTOR pathway in vivo
在体内验证阶段，研究人员采用RT-qPCR、WB和IF等方法进一步检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关分子的表达变化。结果表明，XCYSF可通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路发挥作用，并伴随睾酮水平恢复和睾丸状态改善。该结果说明，XCYSF对LOH的干预并非仅仅表现为终末激素水平的上升，而是可能通过调节与自噬和细胞代谢密切相关的关键信号轴，改善Leydig细胞功能环境，最终促进睾酮合成。
XCYSF-containing serum and tribuloside promoted testosterone secretion in H
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2 -induced TM3 cells
为进一步在细胞水平确认核心机制，研究人员建立了H
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2 诱导的TM3细胞损伤模型。结果显示，XCYSF含药血清能够促进TM3细胞分泌睾酮，且其潜在关键成分刺蒺藜苷同样表现出促进睾酮分泌的效应。进一步研究表明，这一作用同样与PI3K/Akt/mTOR通路抑制有关。该结果从体外层面验证了XCYSF的直接细胞保护和促分泌作用，也提示刺蒺藜苷可能是XCYSF发挥抗LOH效应的重要物质基础之一。
讨论部分表明，XCYSF在临床上已被观察到可改善LOH患者症状并提升睾酮水平，而本研究通过血清药物化学、代谢组学和网络药理学的联合策略，进一步解析了其活性成分与分子机制。研究结果提示，LOH大鼠模型和细胞模型中均存在脂质代谢异常与自噬失衡，XCYSF则通过调控PI3K/Akt/mTOR通路影响Leydig细胞的睾酮合成功能，从而发挥治疗作用。该研究的意义在于，一方面从入血成分角度增强了中药复方药效物质基础研究的真实性，另一方面通过整合多组学与功能验证，将代谢异常、信号通路和细胞功能变化进行了系统衔接，为XCYSF治疗LOH提供了较为完整的实验依据。
研究结论部分可译为：本研究表明，无论在LOH大鼠模型还是细胞模型中，均可能存在脂质代谢异常和自噬异常的改变。此外，XCYSF及其潜在关键活性成分之一刺蒺藜苷治疗LOH的机制，是通过PI3K/Akt/mTOR通路调控Leydig细胞中的睾酮合成。
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