癌症治疗仍是全球重大健康挑战，常需多模式靶向策略，但整合这些模式通常要求复杂的制剂设计。溶瘤细菌疗法为靶向给药及免疫调节提供了独特机遇，但其临床转化受限于安全性顾虑及繁琐的基因工程改造。本研究报道了一种通过一步顺铂(cisplatin, CDDP)诱导形态转变构建的可变形枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, BS)(DBS)，该过程使细菌伸长同时包载化疗药物。所得DBS整合了三种协同抗肿瘤机制：化疗、饥饿及免疫治疗。代谢上，DBS主动消耗肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)内的葡萄糖与乳酸，剥夺肿瘤细胞关键营养并重塑微环境使其更利于治疗。同时，厌氧靶向的DBS在TME内局部释放包载的顺铂，实现直接细胞毒杀伤并限制全身暴露。此外，DBS利用其固有免疫原性促进免疫细胞活化，其伸长形态延长肿瘤滞留并增强与浸润免疫细胞的相互作用。DBS分泌的蛋白酶水解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，促进免疫细胞浸润并增强抗肿瘤免疫反应。值得注意的是，DBS表现出肠道归巢特性，治疗后经粪便安全清除，最大限度降低全身副作用。本研究提出了一种高效安全的活菌平台用于癌症治疗，强调了细菌形态工程作为简便策略在单一微生物治疗中整合多种协同抗肿瘤机制的广阔潜力。
研究背景与意义
癌症传统化疗面临耐药与全身毒性限制，多模式联合是临床主流方向。溶瘤细菌疗法可利用活微生物刺激抗肿瘤免疫并作为代谢调节剂，实体瘤低氧富营养特征适合专性/兼性厌氧细菌定植，但常规细菌在瘤内被快速清除导致疗效受限，现有表面涂层策略又易损害细菌活性。细菌形态调控可影响其与宿主组织及免疫系统互作，但形态工程增强肿瘤治疗尚待探索。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, BS)是公认益生菌，具低氧趋向性、递药载体潜力及强免疫调节能力，可消耗葡萄糖"饿死"肿瘤。本研究由暨南大学研究人员开展并发表于《Materials Today Bio》，研究人员利用顺铂(cisplatin, CDDP)同步诱导BS丝状化(filamentation)及载药，构建可变形枯草芽孢杆菌(Deformable Bacillus subtilis, DBS)，系统阐明其通过化疗-代谢饥饿-免疫三联协同、延长瘤内滞留、分泌蛋白酶降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)、经淋巴归巢肠道并粪排的机理，证明其优于常用工程菌大肠杆菌(Escherichia coli, EC)的安全性，为微生物肿瘤治疗提供简易高效的形态工程新范式。
主要关键技术方法
研究人员将BS与120 μg/mL顺铂共孵育诱导丝状化获得载药DBS，并以撤药后培养验证形态可逆性；用扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)表征形貌，高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测葡萄糖/乳酸消耗及蛋白酶活性，电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)测定顺铂负载量及组织铂分布；构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记菌株，通过活体成像系统(in vivo imaging system, IVIS)监测尾静脉/瘤内注射后各脏器及瘤内滞留、肠道归巢；建立小鼠4T1乳腺荷瘤模型，分别行瘤内及尾静脉注射治疗评估抑瘤效果、瘤内葡萄糖/乳酸/细胞因子/胶原含量、血清炎症及肝肾功能；取瘤旁淋巴结及瘤组织制备单细胞悬液，流式细胞术(flow cytometry)分析树突状细胞(dendritic cell, DC)成熟(CD80+CD86+CD11c+)、巨噬细胞M1(CD86+F4/80+)/M2(CD206+F4/80+)极化及CD4+/CD8+T细胞浸润，免疫荧光染色验证；收集粪便进行宏基因组测序分析肠道菌群变化；部分实验设大肠杆菌(Escherichia coli, EC)为对照。
研究结果
2.1 Induction and Characterization of DBS
研究人员筛选多种菌株后确认BS在顺铂作用下发生最显著丝状化(长径比达~20:1，平均长度由2 μm增至~20 μm)，宽度基本不变，撤去顺铂后48 h恢复原始形态证明可逆性；其他化疗药诱导程度较弱。DBS生长曲线、菌落形成单位与野生BS无差异，保留葡萄糖与乳酸代谢能力及蛋白酶分泌(牛奶琼脂板水解圈)，并可消耗谷氨酰胺。ICP-MS显示DBS顺铂负载量显著高于其他测试菌株，且与伸长程度正相关(增大表面积促进吸附摄取)。与4T1细胞共孵育显示48 h内持续释放约60%包载顺铂，并明显抑制4T1、B16及HCT-8肿瘤细胞活力，证实DBS为具代谢活性的活体顺铂递送系统。
2.2 Macrophage Activation and Cytokine secretion in vitro
研究人员将RAW264.7巨噬细胞与DBS共孵育，发现BS与DBS均显著提升M1型(CD86+F4/80+)巨噬细胞比例，顺铂本身无此作用，说明由细菌组分(脂磷壁酸、肽聚糖等)介导。DBS诱导IL-6与TNF-α分泌水平显著高于BS，表明丝状形态增强免疫原性。FITC标记吞噬实验显示BS在3 h内被快速摄取达平台，DBS摄取缓慢持续至24 h，延长与巨噬细胞接触时间并可能延缓清除，有利于体内持续免疫刺激。
2.3 Enhanced Tumor Accumulation and Prolonged Retention of DBS
研究人员用GFP标记BS/DBS经瘤内及尾静脉注射4T1荷瘤小鼠，IVIS显示瘤内给药后DBS荧光信号衰减慢于BS，48 h仍可检测，定量瘤内累积率DBS(61.75%)高于BS(41.84%)；尾静脉注射后两者均于6 h达瘤内荧光峰值且主要富集于肿瘤，DBS未损靶向能力。非靶器官(心肝脾肺肾)铂含量显著低于游离顺铂组，证实DBS降低全身暴露。
2.4 Antitumor effects through intratumoral injection of DBS
研究人员对荷瘤小鼠行瘤内给药治疗，DBS组抑瘤效果最优(优于BS、EC及游离顺铂)。瘤内检测显示DBS显著降低葡萄糖与乳酸水平(诱导饥饿并逆转免疫抑制微环境)，上调瘤内IL-6与TNF-α(强于BS与EC)；Masson染色及定量显示DBS最大程度降低胶原沉积(ECM降解)，H&E与TUNEL显示最广坏死与凋亡区域。治疗期间小鼠体重稳定，血清C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、降钙素原(procalcitonin, PCT)及炎性因子低于EC组，肝肾功能及主要脏器病理无异常，显示良好安全性。
2.5 Activation of Antitumor Immunity by DBS
研究人员取瘤旁淋巴结流式分析显示DBS组CD80+CD86+成熟DC比例最高；瘤组织内DBS提升M1/M2比值最强；免疫荧光及流式示DBS组瘤内CD4+与CD8+T细胞浸润最多，脾脏CD4+/CD8+T细胞比例亦升高。结果表明DBS通过促进DC成熟、M1极化及T细胞招募浸润，将"冷"肿瘤转化为免疫激活态，并引起系统性免疫启动。
2.6 Antitumor effects mediated by intravenous administration of DBS
研究人员经尾静脉给予同等剂量治疗，DBS仍表现最强抑瘤效果，瘤内葡萄糖/乳酸下降，血清CRP、PCT、IL-6、TNF-α显著低于EC组且无死亡(EC组静脉给药100%死亡)，证实DBS可安全用于静脉全身给药，兼具靶向定植、局部释药、饥饿、微环境重塑与瘤内免疫激活。
2.7 Intestinal Homing Effect of DBS and Improvement of Gut Microbiota
研究人员发现瘤内注入BS-GFP/DBS-GFP后肠道出现荧光，随时间先升后降，粪便培养检出活菌证实经粪便清除；荧光在瘤旁淋巴结(peri-tumoral lymph node, PLN)先于肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)出现，菌落计数示细菌迁移路径为肿瘤→PLN→MLN→小肠/盲肠→粪便，属淋巴途径转运。宏基因组显示归巢肠道的DBS增加有益菌门(芽孢杆菌门Bacillota、拟杆菌门Bacteroidota)，减少潜在致病菌(假单胞菌门Pseudomonadota等)，具调节菌群作用。
讨论与结论翻译
综上所述，本工作证明DBS作为一种细菌治疗制剂，通过靶向顺铂递送、延长滞留、诱导肿瘤饥饿、强效免疫激活及广泛肿瘤微环境重塑等多重互补机制发挥显著抗癌效应。具体而言，DBS作为活体给药系统利用其可变形性高效携带顺铂，通过靶向低氧肿瘤在TME内局部释放顺铂，最大化瘤内药物蓄积并最小化全身暴露。此靶向给药与DBS介导的葡萄糖耗竭协同，剥夺癌细胞主要能源使其对化疗更敏感。此外，DBS强力重塑免疫格局，将免疫抑制性TME转化为免疫许可微环境——这种形态增强的免疫激活表现为促进树突状细胞成熟、巨噬细胞向促炎M1表型极化，以及细胞毒性CD8+T细胞与辅助CD4+T细胞的强效浸润。DBS通过分泌蛋白酶降解阻碍药物与免疫细胞渗透的ECM成分，并代谢乳酸减轻免疫逃逸，从物理与代谢双维度重塑TME。重要的是，完成治疗作用后DBS表现出肠道归巢能力，确保经胃肠道清除且不引起可检测毒性。此外，DBS在肠道可调节菌群组成，促进有益共生菌增殖。本研究突出了细菌形态工程在溶瘤微生物治疗中转化潜力，DBS通过将靶向递药、代谢干扰、免疫激活及TME重塑集成于单一平台，为下一代癌症治疗提供了有力且具临床前景的策略。
