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在CRISPR基因编辑系统的基础上，麻省理工学院的研究人员设计了一种新的工具，可以剪掉有缺陷的基因，并用新的基因替换它们。这种名为PASTE的新技术有望用于治疗由大量突变的缺陷基因引起的疾病，如囊性纤维化。
在CRISPR基因编辑系统的基础上，麻省理工学院的研究人员设计了一种新的工具，可以以一种更安全、更有效的方式，剪掉有缺陷的基因，并用新基因替换它们。使用这个系统，研究人员表明他们可以将多达36000个DNA碱基对的基因传递到几种类型的人类细胞，以及老鼠的肝细胞。这种被称为PASTE的新技术有望用于治疗由大量突变的缺陷基因引起的疾病，如囊性纤维化。
麻省理工学院麦戈文大脑研究所的麦戈文研究员Omar Abudayyeh说:“这是一种新的基因方法，可以潜在地针对这些很难治疗的疾病。我们希望朝着基因疗法最初应该做的方向努力，那就是替换基因，而不仅仅是纠正个体突变。”
这种新工具结合了对CRISPR-Cas9(一组最初来源于细菌防御系统的分子)和一种被称为整合酶的酶的精确靶向，病毒利用这种酶将自己的遗传物质插入细菌基因组。
“就像CRISPR一样，这些整合酶来自于细菌和感染它们的病毒之间持续的战斗，”麦戈文研究员Jonathan Gootenberg说。“这说明了我们如何从这些自然系统中不断发现大量有趣和有用的新工具。”
Gootenberg和Abudayyeh是这项新研究的资深作者，今天发表在《Nature Biotechnology》上。
DNA插入
CRISPR-Cas9基因编辑系统由一种名为Cas9的DNA切割酶和一条短RNA链组成，短RNA链引导这种酶到达基因组的特定区域，指导Cas9在哪里切割。当Cas9和靶向疾病基因的引导RNA被传递到细胞中时，基因组中会有一个特定的切口，细胞的DNA修复过程会将切口粘合在一起，通常会删除基因组的一小部分。
如果DNA模板也被传递，细胞可以在修复过程中将一个修正的拷贝合并到它们的基因组中。然而，这一过程需要细胞在DNA中进行双链断裂，这可能导致对细胞有害的染色体缺失或重排。另一个限制是它只在分裂的细胞中起作用，因为未分裂的细胞没有活跃的DNA修复过程。
麻省理工学院的研究小组想要开发一种工具，可以在不引起任何双链DNA断裂的情况下，切割出有缺陷的基因，并用新的基因替换它。为了实现这一目标，他们求助于一种叫做整合酶的酶家族，这种酶被称为噬菌体的病毒用来插入细菌基因组。
在这项研究中，研究人员专注于丝氨酸整合酶，它可以插入巨大的DNA块，大到5万个碱基对。这些酶的目标是被称为附着位点的特定基因组序列，它起着“着陆垫”的作用。当它们在宿主基因组中找到正确的着陆点时，就会与之结合，整合它们的DNA负载。
在过去的工作中，科学家们发现开发这些酶用于人类治疗是很有挑战性的，因为着陆垫非常特定，很难对整合酶进行重编程以定位其他位点。麻省理工学院的研究小组意识到，将这些酶与插入正确着落位点的CRISPR-Cas9系统结合，将使强大的插入系统容易重新编程。
新的工具，PASTE(可编程添加通过位点特异性靶向元件)，包括一种Cas9酶，在与该位点结合的RNA链的引导下，切割特定的基因组位点。这使得他们可以针对基因组中的任何位置插入登陆位点，登陆位点包含46个DNA碱基对。这种插入可以在不引入任何双链断裂的情况下完成，首先通过融合的逆转录酶添加一条DNA链，然后是它的互补链。
一旦登陆位点被整合，整合酶就会出现并将其更大的DNA负载插入到该位点的基因组中。
“我们认为这是实现可编程DNA插入梦想的一大步，”Gootenberg说。“这种技术可以很容易地根据我们想要整合的网站和货物进行定制。”
基因替换
在这项研究中，研究人员表明，他们可以使用PASTE将基因插入几种类型的人类细胞，包括肝细胞、T细胞和淋巴母细胞(未成熟的白细胞)。他们用13个不同的有效载荷基因测试了这个传递系统，其中包括一些可能具有治疗价值的基因，并能够将它们插入基因组的9个不同位置。
在这些细胞中，研究人员能够以5%到60%的成功率插入基因。这种方法在基因整合的位点上也产生了很少的不需要的“内嵌”(插入或删除)。
Abudayyeh说:“我们看到很少的内链，因为我们没有双链断裂，你不必担心染色体重排或大规模的染色体臂缺失。”
研究人员还证明，他们可以在“人性化”的小鼠肝脏中插入基因。这些小鼠的肝脏由大约70%的人类肝细胞组成，而PASTE成功地将新基因整合到这些细胞中的2.5%。
研究人员在这项研究中插入的DNA序列长达36000个碱基对，但他们相信甚至可以使用更长的序列。人类基因的碱基对从几百个到200多万个不等，尽管出于治疗目的，只需要使用蛋白质的编码序列，这大大减少了需要插入基因组的DNA片段的大小。
研究人员现在正在进一步探索使用这种工具替代有缺陷的囊性纤维化基因的可能性。这项技术也可以用于治疗由缺陷基因引起的血液病，如血友病和G6PD缺乏症，或亨廷顿舞蹈病，一种由缺陷基因有太多基因重复引起的神经系统疾病。
研究人员还将他们的基因结构放到了网上，供其他科学家使用。
“工程这些分子技术的奇妙之处在于，人们可以在它们的基础上，以我们可能没有想到或没有考虑过的方式开发和应用它们，”Gootenberg说。“能成为这个新兴社区的一员真是太棒了。”
Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases
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