综述：乳腺癌研究中的CRISPR筛选方法

这篇综述系统阐述了CRISPR-Cas9技术在乳腺癌研究中的应用进展，重点介绍了基于CRISPR的功能基因组学筛选（包括CRISPRa/i、碱基编辑等变体）如何揭示乳腺癌进展、转移和治疗抵抗的关键驱动基因（如ERα、HER2、BRCA1/2），并探讨了靶向mTOR、CDK4/6、PARP等通路的联合治疗策略。文章还总结了体外/体内筛选模型（如CTC类器官）的技术挑战与未来方向，为开发新型乳腺癌疗法提供了多维度视角。

CRISPR筛选技术重塑乳腺癌研究范式

1. 技术革命：从基因剪刀到多功能工具箱

CRISPR-Cas9系统源自细菌免疫机制，其sgRNA引导的Cas9核酸酶可通过NHEJ修复机制实现基因敲除。衍生技术如CRISPRa（dCas9融合转录激活因子）和CRISPRi（dCas9融合抑制因子）能精细调控基因表达，而碱基编辑器（ABE/CBE）和Prime编辑器则实现无DSB的精准编辑。Cas13家族更拓展至RNA水平调控，为lncRNA研究提供新工具（如KILR lncRNA通过CRISPR-Cas13d筛选发现调控RPA1）。

2. 筛选设计：从文库构建到模型创新

基因组级文库（如GeCKOv2、Brunello）需包含4-6个sgRNA/基因及阴阳性对照。创新策略包括：

• 空间筛选：CRISPRmap技术结合原位蛋白检测

• 单细胞多组学：Perturb-seq同步分析sgRNA与转录组

• 体内模型：CTC细胞（Brx-82）尾静脉注射筛选转移驱动基因（如核糖体蛋白RPL15⁵²）

• 3D类器官：患者来源CTC类器官揭示NRG1-ERBB3生存依赖

3. 关键发现：乳腺癌的分子弱点图谱

驱动基因挖掘：

• 超级增强子筛选发现BAMBI促进TNBC生长

• 染色质调控因子PHF5A通过SF3b剪接体抑制凋亡

• 伪基因MGAT4EP与FOXA1互作激活FOXM1

治疗抵抗机制：

• 内分泌治疗：ARID1A缺失导致ER⁺乳腺癌luminal特性丢失

• PARPi耐药：CST复合体缺陷保护DNA末端

• CDK4/6抑制剂：METTL14-m⁶A-E2F1轴介导逃逸

4. 免疫微环境：CRISPR照亮"冷肿瘤"

• T细胞调控：DHX37敲除增强CD8⁺T细胞浸润

• 巨噬细胞重编程：Cop1缺失减少M2型极化

• 免疫检查点：NFE2L1/MAFG-BRD4调控PD-L1表达

5. 挑战与展望

当前局限包括sgRNA脱靶效应（需CHOPCHOP优化设计）和模型异质性（如PDX维持原始TME）。未来方向聚焦：

• 双基因筛选揭示合成致死（如PRMT5-RB1缺失协同效应）

• 空间多组学解析转移生态位

• 碱基编辑模拟临床突变（如PARP1耐药突变）

这项技术正推动乳腺癌研究从单基因分析迈向系统级干预，为精准医疗提供全新路线图。