细菌TIR免疫系统通过感知噬菌体衣壳蛋白激活抗病毒防御机制

本研究揭示了Thoeris系统通过识别噬菌体主要衣壳蛋白(Mhp)激活细菌免疫的新机制。研究人员发现金黄色葡萄球菌ThsB1/ThsB2传感器与Mhp形成三元复合物，催化生成1"-3'-gcADPR信号分子，进而激活ThsA效应蛋白降解NAD+限制病毒增殖。该发现不仅阐明了原核生物TIR结构域识别病毒结构的保守机制，还为理解病毒衣壳结构多样性进化提供了新视角。

在微生物与病毒的永恒军备竞赛中，细菌进化出了复杂多样的抗噬菌体防御系统。其中Thoeris系统因其含有与真核生物Toll/白细胞介素-1受体(TIR)同源的结构域而备受关注。虽然已知该系统通过合成环状腺苷二磷酸核糖(gcADPR)信号分子激活效应蛋白ThsA降解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)来抑制噬菌体增殖，但长期以来科学家们一直困惑：细菌如何感知噬菌体入侵并启动这一精确的防御机制？这个黑箱问题成为理解原核生物免疫识别机制的关键瓶颈。

发表在《Nature Microbiology》的这项研究首次揭开了这一谜团。研究团队以金黄色葡萄球菌Thoeris系统(ThsA-B1-B2)为模型，通过系统的遗传学、生物化学和结构生物学方法，证明了噬菌体主要衣壳蛋白(Mhp)是激活免疫系统的关键分子。令人惊讶的是，不仅葡萄球菌的Thoeris系统采用这一识别机制，链球菌的同源系统也遵循相似的原理，表明这可能是细菌界一种保守的免疫识别策略。

研究采用的关键技术方法包括：噬菌体侵染实验、基因编辑技术（原噬菌体重组工程）、蛋白质复合物纯化与质谱分析、高效液相色谱(HPLC)检测核苷酸代谢产物、NAD⁺比色法测定、α-折叠3(AlphaFold3)结构预测与比对、尺寸排阻色谱(SEC)与质谱光度法分析蛋白质复合物化学计量等。实验所用细菌菌株和噬菌体均来自标准实验室保藏库。

Thoeris在葡萄球菌中提供抗噬菌体保护

研究人员首先确认了来自金黄色葡萄球菌08BA02176菌株的Thoeris系统由thsA、thsB1和thsB2三个基因组成。表达完整操纵子的菌株对Φ80α-vir、ΦNM1γ6等多种噬菌体产生明显抗性，而仅表达thsB1/B2的菌株则无此效果。通过监测NAD(H)水平变化和GFP标记噬菌体感染过程，发现完整Thoeris系统激活后会导致NAD⁺耗竭，抑制噬菌体增殖而不引起细胞裂解。

噬菌体主要头蛋白在体内激活Thoeris

为揭示免疫激活机制，团队分离了能逃逸Thoeris防御的噬菌体突变体。全基因组测序发现所有逃逸株均在编码主要头蛋白(Mhp)的gp47基因携带V273A错义突变。诱导野生型ΦNM1原噬菌体而非缺失Mhp基因(Δgp43)的突变体后，NAD(H)水平显著降低，证明Mhp是触发Thoeris应答的必要条件。更重要的是，单独表达野生型Mhp（非V273A突变体）即可激活Thoeris防御，导致NAD(H)耗竭和细胞生长抑制，表明Mhp是激活免疫的充分必要条件。

ThsB1、ThsB2和Mhp在体内形成活性复合物

通过蛋白质亲和纯化与质谱分析，研究人员发现噬菌体感染后，ThsB1和ThsB2与Mhp形成稳定复合物。该复合物具有NAD⁺环化酶活性，能催化生成1"-3'-gcADPR。定点突变实验表明ThsB2的E81和F6残基对其环化酶活性至关重要，而ThsB1的对应突变不影响免疫功能，提示ThsB2是负责第二信使合成的关键催化亚基。

ThsB1与Mhp互作招募并激活ThsB2

体外重组实验显示，Mhp与ThsB1以1:1化学计量形成亚复合物，进而招募ThsB2形成功能性三元复合物。有趣的是，逃逸突变V273A位于Mhp的P环，虽不影响与ThsB1结合，但阻碍了ThsB2的招募；而另一逃逸突变W84K（位于E环）则完全破坏Mhp与ThsB1/ThsB2的相互作用。这些结果支持了分步激活模型：Mhp通过E环与ThsB1结合，再通过P环介导ThsB2招募，最终激活ThsB2的环化酶活性。

Mhp和ThsB1在体外足以激活ThsB2

生化重建实验证实，纯化的Mhp、ThsB1和ThsB2在NAD⁺存在下即可生成1"-3'-gcADPR，而该信号分子能有效激活ThsA的NAD⁺水解活性。这一最小系统实验证明Mhp是直接激活Thoeris信号通路的唯一病毒因子，无需其他细胞成分参与。

Sau-Thoeris被多种葡萄球菌噬菌体的Mhp激活

系统评估不同噬菌体Mhp的激活能力发现，除Φ12y3外，所有敏感噬菌体的Mhp均能触发Thoeris防御。进化分析和结构比对显示，Φ12y3的Mhp在序列和结构上（RMSD >2Å）与其他噬菌体存在显著差异，这解释了其逃逸识别的分子基础。值得注意的是，敏感噬菌体均属于B血清型（等距衣壳），而抵抗噬菌体Φ12y3属于A血清型（长形衣壳），提示Thoeris识别可能促进了噬菌体衣壳结构的多样性进化。

马链球菌Thoeris免疫也被Mhp激活

跨物种研究表明，马链球菌(Streptococcus equinis)的Thoeris系统同样通过识别Mhp激活防御，但其催化中心位于ThsB1而非ThsB2。该系统对多种链球菌噬菌体的Mhp产生应答，表明Mhp识别机制在细菌界具有广泛保守性。

本研究最终揭示了Thoeris系统通过直接识别噬菌体主要衣壳蛋白激活免疫的分子机制。该发现不仅解决了细菌如何感知噬菌体入侵这一长期悬而未决的问题，更深化了我们对宿主-病毒共进化规律的理解。从免疫学角度看，靶向高度保守且必需的病毒结构蛋白（如Mhp）确保了防御系统的广谱性和持久性。而噬菌体通过积累衣壳突变逃逸识别，则成为推动病毒结构多样性的重要进化力量。更广泛地说，考虑到动物免疫系统中也存在识别病毒结构的TIR结构域，该研究揭示了从细菌到哺乳动物的先天抗病毒免疫保守机制，为理解免疫系统的起源和进化提供了重要线索。