角质形成细胞中EV易感基因CIB1、TMC6、TMC8对β-HPV8限制作用的新证据：缺乏表达诱导与抗病毒活性支持

本研究针对疣状表皮发育不良(EV)易感基因CIB1、TMC6、TMC8是否作为β-人乳头瘤病毒(HPV)限制因子这一关键科学问题，通过siRNA敲低技术和HPV8微小环基因组转染模型，首次在正常人角质形成细胞中系统评估了这些基因对β-HPV8转录的调控作用。研究发现尽管能有效敲低基因表达，但并未激活HPV8转录；同时揭示TMC6/8在角质形成细胞中本底表达极低且难以被DNA感知、DNA损伤、细胞分化或免疫细胞因子等途径诱导。该成果对重新理解EV发病机制具有重要意义，支持免疫缺陷而非角质形成细胞自主性抗病毒机制可能是表型主因，相关论文发表于《Tumour Virus Research》。

在病毒学与皮肤病学交叉领域，一个长期困扰研究者的谜题是疣状表皮发育不良（Epidermodysplasia Verruciformis, EV）的发病机制。这种罕见的常染色体隐性遗传病患者表现出对β属人乳头瘤病毒（Beta-Human Papillomavirus, beta-HPV）的极端易感性，皮肤上会出现广泛存在的疣状病变，且多年后易发展为皮肤鳞状细胞癌。遗传学研究已将病因锁定在三个基因上：TMC6（编码跨膜通道样蛋白6，亦称EVER1）、TMC8（编码跨膜通道样蛋白8，亦称EVER2）和CIB1（编码钙和整合素结合蛋白1）。这三种蛋白在内质网中形成复合物，主流假说认为该复合物在角质形成细胞（keratinocytes）中充当了限制β-HPV复制的“限制因子”（restriction factor）。然而，这一假说存在一个关键疑点：EV患者除了对beta-HPV易感外，其他免疫学表现非常轻微，这似乎更支持角质形成细胞自主的抗病毒机制；但另一方面，某些免疫缺陷状态（如器官移植后）也会出现类似EV的表现，且在免疫恢复后好转，这又暗示免疫系统可能扮演了更重要的角色。此外，近期小鼠模型显示，鼠类的Tmc6和Tmc8并不限制鼠乳头瘤病毒（Mus musculus PV1, MmuPV1）在角质形成细胞中的基因表达，而是影响了病毒清除，这使问题更加复杂。那么，在人类系统中，CIB1-TMC6-TMC8复合物究竟是通过直接在角质形成细胞中抑制病毒，还是通过影响免疫系统来发挥保护作用？这个根本问题由于缺乏合适的人类beta-HPV研究模型一直悬而未决。

为了解决这一争议，由Tina M. Rehm、Thomas Iftner和Frank Stubenrauch等领导的研究团队在《Tumour Virus Research》上发表了他们的最新研究。他们利用先进的HPV8微小环（minicircle）基因组转染技术和高效率的siRNA基因敲低（knock-down）方法，在正常人角质形成细胞（Normal Human Keratinocytes, NHK）中直接检验了CIB1-TMC6-TMC8复合物是否对beta-HPV8的基因表达具有限制作用。同时，他们探索了多种生理和病理刺激能否诱导角质形成细胞中TMC6和TMC8的表达，以期找到该复合物可能被激活并发挥功能的条件。

研究人员采用的关键技术方法包括：siRNA介导的基因敲低技术用以有效降低CIB1、TMC6、TMC8的转录本和蛋白水平；HPV8微小环基因组转染至原代正常人角质形成细胞，以模拟病毒早期基因表达；定量PCR（qPCR）用于精确检测病毒转录本（URRˆE2, URRˆE4, E1ˆE2, E1ˆE4）及宿主基因表达；蛋白质免疫印迹（Immunoblot）用于验证蛋白敲低效率；以及利用佛波酯处理的角化细胞构建器官样培养物（organotypic cultures）诱导细胞分化。研究中使用的正常人角质形成细胞来源于包皮组织，原代CD4⁺ T细胞和外周血单核细胞（PBMCs）来源于健康献血者的血沉棕黄层。

3. 结果

3.1. 培养的人角质形成细胞表达不同水平的CIB1、TMC6和TMC8转录本，并可被siRNA有效敲低

研究人员首先分析了公共数据库和实验数据，发现与CD4⁺ T细胞相比，正常人角质形成细胞、HPV16阳性或beta-HPV49 E8-永生化角质形成细胞中TMC6和TMC8的转录本水平显著更低，CIB1水平也有所降低，且HPV感染并未显著改变这些基因的表达。随后，他们验证了针对CIB1、TMC6和TMC8的siRNA均能有效降低其对应的mRNA和蛋白水平，为后续功能研究奠定了基础。

3.2. 敲低CIB1、TMC6或TMC8并不调节人角质形成细胞中HPV8转录本水平

核心实验发现，尽管siRNA能有效敲低CIB1、TMC6或TMC8，但转染了HPV8基因组的角质形成细胞中，四种主要的病毒剪接转录本（URRˆE2, URRˆE4, E1ˆE2, E1ˆE4）水平均未出现统计学上显著的激活。即使使用不同的单个CIB1 siRNA进行验证，虽然个别siRNA显示出轻微波动，但均未产生一致且显著的病毒转录激活效应。这一结果直接挑战了CIB1-TMC6-TMC8复合物作为beta-HPV8转录限制因子的假说。

3.3. DNA感知、DNA损伤、角质形成细胞分化或活化免疫细胞上清液均不诱导TMC8转录本

考虑到TMC6/TMC8在角质形成细胞中本底表达很低，研究者假设可能需要特定信号诱导其高表达后才能发挥抗病毒功能。为此，他们系统测试了多种可能诱导TMC6/TMC8表达的刺激条件：1）通过转染DNA激活cGAS/STING通路（以IFNB1诱导为标志）未能诱导TMC6或TMC8；2）使用丝裂霉素C（Mitomycin C）诱导DNA损伤反应（以γH2AX和CDKN1A/p21诱导为标志）仅微弱诱导TMC6，不诱导TMC8；3）在器官样培养物中诱导角质形成细胞分化（以KRT10诱导为标志）不诱导CIB1、TMC6或TMC8；4）用活化免疫细胞（PBMCs）的上清液处理（以CXCL10诱导为标志）也不诱导TMC6或TMC8，反而降低了CIB1。这些结果表明，在正常人角质形成细胞中，缺乏有效的信号通路能将TMC6/TMC8表达诱导至可能发挥抗病毒功能的水平。

4. 讨论与结论

本研究通过严谨的实验设计，在最相关的人类原代角质形成细胞模型中发现，敲低EV易感基因CIB1、TMC6或TMC8并不能释放beta-HPV8的转录活性。同时，一系列与HPV生命周期或抗病毒免疫相关的刺激条件也无法有效上调角质形成细胞中TMC6和TMC8的表达，尤其是TMC8的表达始终维持在极低水平。这些证据共同表明，内源性的CIB1-TMC6-TMC8复合物在正常人角质形成细胞中可能并不充当beta-HPV8基因表达的直接限制因子。

这一结论与近期小鼠模型中使用MmuPV1的研究结果相互印证，即鼠类的Tmc6/Tmc8缺失并不影响病毒在角质形成细胞中的基因表达。综合来看，本研究的结果强烈支持对EV发病机制的另一种解释：CIB1-TMC6-TMC8复合物的功能缺失可能主要通过影响免疫系统，特别是细胞免疫应答，从而导致机体无法有效控制和清除beta-HPV感染，而非直接在病毒感染的角质形成细胞内部抑制病毒。这为理解EV疾病的本质提供了新的方向，将研究焦点从上皮细胞自主的防御机制转向了更复杂的免疫调节机制。未来研究需要深入探索这些基因在免疫细胞（如CD4⁺ T细胞中高表达）中的具体功能，以及它们如何参与抗乳头瘤病毒的特异性免疫应答。这项研究不仅澄清了一个长期存在的科学问题，也为开发针对EV及相关疾病的治疗策略提供了重要的理论依据。