α-烯醇酶通过调控糖酵解影响胃癌干细胞特性的代谢-信号轴机制研究

语 本研究针对胃癌干细胞特性维持的代谢调控难题，首次揭示糖酵解酶ENO1通过提升胞内ATP池与乳酸稳态，协同激活PI3K/AKT并抑制AMPK/mTOR通路，从而驱动胃癌干细胞自我更新与转移。团队创新性提出“ATP浓度依赖性直接激活PI3K/AKT”机制，并验证靶向ENO1-ATP/乳酸轴联合代谢抑制剂（二甲双胍+Syrosingopine）的协同抑瘤效果，为胃癌靶向代谢干预提供新策略。

胃癌是全球癌症相关死亡的第四大原因，在东亚地区发病率较高。尽管治疗手段有所进步，但由于耐药性问题，胃癌患者的生存率仍然不理想。肿瘤代谢重编程，尤其是有氧糖酵解（Warburg效应），与肿瘤干细胞特性的维持密切相关。糖酵解中间产物或终产物的异常增加被认为是癌症干细胞特性增强和化疗抵抗的标志。因此，研究抑制肿瘤代谢的特异性靶点具有重要的临床意义。

α-烯醇酶（ENO1）是糖酵解通路中的一种酶，但其在肿瘤进展中促进糖酵解本身及其下游调控的作用尚不清楚。ENO1作为一种关键的RNA结合蛋白和多功能癌蛋白，在多种癌症中受到关注，但其通过糖酵解代谢产物调控肿瘤干细胞特性的详细机制仍有待阐明。PI3K/AKT和AMPK/mTOR信号通路是调控细胞代谢、增殖、存活和转移的核心通路，在胃癌等癌症中常被异常激活。然而，针对这些通路的抑制剂其长期疗效常因耐药性而受限，这凸显了需要同时靶向信号通路和肿瘤代谢的联合策略。

为此，研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上发表了题为“Alpha-enolase influences ATP pool of cytoplasm and lactate homeostasis by regulating glycolysis in gastric cancer”的研究论文，旨在深入探究ENO1如何通过糖酵解调控癌细胞干细胞特性的详细机制。

为开展本研究，作者主要应用了以下关键技术方法：利用组织微阵列和免疫组化分析临床胃癌样本中ENO1的表达与预后关联；通过慢病毒转染构建ENO1基因敲低和过表达的胃癌细胞系模型；采用RNA测序（RNA-Seq）进行转录组分析和生物信息学分析（如GO、KEGG、GSEA）；通过蛋白质印迹法分析关键信号通路蛋白（如PI3K/AKT、AMPK/mTOR）及干细胞/上皮-间质转化（EMT）标志物的表达；使用细胞球形成实验、Transwell小室实验分别评估细胞自我更新能力、迁移和侵袭能力；利用靶向能量代谢组学（LC-MS/MS）分析代谢物变化；通过膜透化实验和代谢物（ATP、乳酸）补充实验模拟胞内代谢环境；以及建立小鼠异种移植瘤模型和肺转移模型进行体内药效验证。

研究结果

ENO1在胃癌中高表达且与不良预后及干细胞样特性相关

研究发现，与癌旁正常组织相比，ENO1在胃癌组织中的表达显著升高，且ENO1高表达与患者不良预后相关。在细胞模型中，ENO1过表达促进了胃癌细胞的球体形成、迁移、侵袭能力以及干细胞标志物（如SOX2、OCT4、Nanog）的表达，而敲低ENO1则呈现相反趋势。体内实验进一步证实，ENO1高表达显著增加了小鼠的肺转移。

高表达ENO1通过介导PI3K/AKT激活和AMPK/mTOR失活增强胃癌干细胞特性

RNA-Seq和通路富集分析表明，ENO1敲低细胞的差异表达基因富集于代谢通路、AMPK/mTOR等信号通路。蛋白质印迹验证显示，ENO1差异表达显著改变了AKT/mTOR通路和AMPK的磷酸化状态。使用PI3K抑制剂（LY294002）和AMPK激活剂（AICAR）等工具药进行功能回复实验，证实ENO1通过激活PI3K/AKT信号并抑制AMPK/mTOR信号来增强胃癌细胞的干细胞样特性。

同时靶向PI3K/AKT通路和AMPK/mTOR通路具有良好的抗肿瘤效果

体外实验表明，同时使用AICAR和LY294002可强烈抑制ENO1过表达胃癌细胞的自我更新、迁移和侵袭能力。使用临床相关药物二甲双胍（MET，AMPK激活剂）和Copanlisib（COPAN，PI3K抑制剂）的联合治疗在体外也显示出协同抑制效果，但在小鼠体内模型中对肿瘤增殖的抑制效果未达显著差异，提示需寻找更有效的联合策略。

ENO1通过激活糖酵解增加乳酸和胞质ATP的产生，进而调控PI3K/AKT和AMPK/mTOR通路，最终促进肿瘤转移和干细胞特性

对TCGA数据库和RNA-Seq结果的分析表明，ENO1高表达患者具有更高的糖酵解相关评分，并影响关键糖酵解产物ATP和乳酸的水平。能量代谢组学分析显示，ENO1敲低导致糖酵解通路代谢物发生显著改变，其中ATP和乳酸产量明显降低。整合通路分析证实差异表达基因和代谢物显著富集于PI3K/AKT和AMPK信号通路。使用糖酵解抑制剂2-DG可逆转ENO1诱导的恶性表型，说明ENO1主要通过糖酵解调控这些通路。

增加的胞质ATP池以浓度依赖性方式直接激活PI3K/AKT信号，驱动胃癌进展

研究人员通过膜透化实验建立具有不同胞内ATP浓度的细胞模型，发现PI3K/AKT信号的激活程度随胞内ATP浓度变化而变化。补充ATP并待细胞膜恢复后，胃癌细胞的干细胞标志物表达、迁移、侵袭和球体形成能力均显著增强，表明高浓度胞内ATP可通过激活PI3K/AKT通路促进胃癌干细胞特性。

增加的胞内乳酸以浓度依赖性方式促进胃癌侵袭和干细胞特性，该过程依赖于糖酵解来源的ATP介导的PI3K/AKT通路激活

外源性乳酸补充可提高胞内乳酸水平，并以剂量依赖的方式增强胃癌细胞的迁移、侵袭、自我更新能力、整体乳酸化水平以及干细胞/EMT相关标志物表达。乳酸的促癌功能依赖于PI3K/AKT通路的激活。进一步实验发现，乳酸的促肿瘤作用需要糖酵解来源的ATP同时存在，而非线粒体来源的ATP。

联合靶向ATP池和乳酸稳态与二甲双胍和Syrosingopine可协同抑制GC细胞的干细胞特性，从而更有效地抑制肿瘤生长

考虑到直接靶向糖酵解可能产生毒性，研究人员选择了临床相关药物二甲双胍（MET，主要降低胞内ATP池）和Syrosingopine（SYRO，破坏乳酸稳态）。MET和SYRO联合使用可协同降低胞内ATP和乳酸水平，更有效地抑制PI3K/AKT通路、激活AMPK通路，并显著抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成、自我更新、迁移和侵袭能力，以及干细胞/EMT标志物表达。在小鼠皮下异种移植瘤模型中，MET与SYRO联合治疗显示出最高的肿瘤抑制率。

研究结论与讨论

本研究首次揭示了糖酵解酶ENO1通过调控糖酵解，影响胞质ATP池和乳酸稳态，进而协同调控AMPK/mTOR和PI3K/AKT信号通路，最终促进胃癌干细胞特性和进展的多层面作用。创新性地提出了胞内ATP池以浓度依赖性方式直接激活PI3K/AKT通路的新机制，以及乳酸的功能依赖于糖酵解来源ATP的协同作用。研究还表明，乳酸微稳态可通过影响整体乳酸化水平促进肿瘤干细胞特性。

这项研究深入分析了胞内代谢物与肿瘤干细胞特性之间的复杂相互作用。更重要的是，研究团队提出了一种具有转化潜力的新策略：使用临床可用药物（二甲双胍和Syrosingopine）靶向ENO1-ATP/乳酸-AMPK/PI3K/AKT-mTOR轴上的多个节点，在临床前模型中显示出协同抗肿瘤效果，为连接实验室研究和胃癌临床治疗提供了新的思路。尽管完全在体外或体内模型中重现人类肿瘤微环境的复杂性仍具挑战性，且直接靶向糖酵解可能存在毒性问题，但本研究为开发针对肿瘤代谢和信号通路交叉对话的联合疗法奠定了重要基础。未来的研究可结合实时代谢生物传感器和动态示踪等技术，进一步阐明ENO1调控的代谢功能与机制，以及代谢过程与肿瘤治疗之间的复杂关系。