新型融合蛋白 REA：结核病疫苗研究的新突破

在结核病防控形势严峻的当下，韩国忠南国立大学医学院微生物学与医学科学系的研究人员取得了一项重要成果，相关论文 “Novel fusion protein REA induces robust prime protection against tuberculosis in mice” 发表于npj Vaccines期刊。该研究开发出一种新型融合蛋白疫苗候选物 REA，为结核病疫苗的研发带来了新的希望，对全球结核病防治具有重要意义。

研究背景

结核病（TB）是严重的呼吸道传染病，2022 年全球因结核病死亡人数超 130 万。新冠疫情使结核病的诊断和治疗受阻，且全球约四分之一人口感染潜伏性结核。目前唯一获批用于人类的结核病疫苗是卡介苗（BCG），但其对青少年和成人肺结核的保护效力差异大（0%-80%），因此开发更有效的结核病疫苗迫在眉睫。

近几十年来，结核病疫苗研究聚焦于结核分枝杆菌（MTB）的免疫调节元件。许多基于 MTB 蛋白的疫苗候选物处于临床试验或临床前阶段，将不同 MTB 蛋白组合成多重复合疫苗可增强疗效。ESAT-6 和 Ag85B 是常用的 T 细胞刺激抗原，被广泛应用于结核病复合疫苗中，但这些疫苗仍存在 T 细胞到达作用位点时间长、细菌载量降低不足等问题。此外，激活树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的抗分枝杆菌蛋白也是新型结核病疫苗开发的有吸引力的靶点，因为 MTB 可通过抑制吞噬体成熟和 DCs 成熟来逃避宿主免疫反应，所以激活抗原呈递细胞（APCs）和 T 细胞以增强细胞内细菌杀伤对根除 MTB 至关重要。

研究材料与方法

实验动物：选用 5-6 周龄的雌性 C57BL/6 和 C57BL6 OT-II TCR 转基因小鼠，在韩国忠南国立大学医学研究中心的 ABSL-3 设施中饲养，环境条件严格控制。
细胞培养：分别培养骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），培养条件不同，BMDMs 使用含特定成分的 DMEM 培养基，BMDCs 使用含多种添加物的 RPMI 1640 培养基。
细菌培养：培养 MTB H37Rv、H37Ra 和牛分枝杆菌卡介苗（BCG 东京株）等，使用特定的 7H9 培养基，实验在生物安全二级（BSL2）实验室进行，并构建了表达红色荧光蛋白的 MTB（RFP-MTB）。
重组蛋白表达与生产：通过 PCR 从 MTB 基因组 DNA 扩增相关基因，克隆到 pET22b (+) 载体，转化到大肠杆菌 BL21 细胞，用 Ni-NTA 树脂纯化蛋白，去除内毒素并检测纯度、细胞毒性和内毒素含量。
实验方法：采用多种实验方法检测 REA 的效果，如细胞毒性分析、ELISA 检测细胞因子水平、测量 ROS、体外 T 细胞增殖试验、细胞表面染色和流式细胞术分析、用信号通路抑制剂处理 BMDMs、免疫印迹分析、基因沉默、检测 MTB 细胞内存活、免疫荧光和共聚焦显微镜观察、评估疫苗效力等，每种方法都有特定的操作流程和检测指标。

研究技术路线

研究人员首先构建了重组 Rv2299cD2D3-ESAT6-Ag85B（REA）融合蛋白，改变了 Rv2299c-Ag85B-ESAT6 疫苗的蛋白顺序并去除 Rv2299c 非免疫原性的 N 端 D1 结构域。接着对 REA 进行纯化和质量鉴定，随后在体外实验中，用 REA 刺激 BMDMs 和 BMDCs，检测细胞因子分泌、细胞表面分子表达和 T 细胞增殖情况；研究 REA 对 MTB 感染的 BMDMs 内 MTB 生长、吞噬体成熟相关信号通路的影响。在体内实验中，用 REA 免疫小鼠，然后用 MTB H37Ra 或 H37Rv 菌株攻击，检测细菌载量、细胞因子分泌、免疫细胞表型等，以此评估 REA 的疫苗效力。

研究结果

1.REA 诱导 APCs 激活

从大肠杆菌 BL21 (DE3) 提取物中纯化出 REA，其纯度、细胞毒性和内毒素含量符合要求。REA 可刺激 BMDMs 和 BMDCs 以剂量依赖方式产生 IL-12 和 TNF-α，高浓度时诱导 IL-10 产生，且显著上调 APCs 中 MHC-II、CD80 和 CD86 的表达。用 OT-II TCR 转基因 CD4+ T 细胞进行的同基因体外增殖试验表明，REA 成熟的 BMDCs 可诱导 T 细胞显著增殖，并产生 IL-17、IL-2 和 IFN-γ，效果与 LPS 处理的 BMDCs 相当，但 LPS 成熟的 BMDCs 分泌更高水平的 IL-4。此外，REA 可激活 BMDMs 中的 MAPK 信号通路，包括 p38 MAPK 和 ERK1/2，还可磷酸化 GSK-3β、PI3K 和 AKT，增强 IκBα 降解，促进 NF-κB 颗粒 P65 的转位和结合，而激酶抑制剂可显著抑制共刺激分子表达和细胞因子产生。通过这些细胞实验得出结论：REA 可影响 DCs 和巨噬细胞激活，并引导幼稚 T 细胞向 Th1 和 Th17 表型增殖。

2.REA 抑制 MTB 细胞内生长并增强 BMDMs 早期内体成熟

与单独使用 Rv2299c、LPS 或未处理的对照组相比，REA 处理的 BMDMs 中 MTB 细胞内生长显著受到抑制。REA 或 LPS 处理 MTB 感染的巨噬细胞可增强 MHC 和共刺激分子表达以及促炎细胞因子的产生，且 REA 处理的巨噬细胞产生的 IL-12 比单独使用 LPS 时更多。在探究 REA 抗分枝杆菌作用机制时发现，REA 处理的 BMDMs 中 RAB5 定位于 RFP-MTB 吞噬体的比例显著增加，I 类 PI3K 磷酸化迅速增强，hVPS34 在 MTB 吞噬体中的共定位强度显著高于其他处理组，EEA1 的募集也显著增加。同时，REA 处理可诱导 p38 MAPK 磷酸化，且 PI3K 磷酸化也增强，p38 MAPK 和 PI3K 抑制剂可抑制 REA 诱导的 MTB 生长抑制。基于这些细胞内 MTB 生长和相关分子变化的研究得出：REA 可克服 MTB 诱导的巨噬细胞抑制，P38-PI3K 信号通路对 REA 介导的 BMDMs 在 MTB 感染期间的吞噬体成熟很重要。

3.REA 增强吞噬体酸化和溶酶体融合

REA 强烈诱导 Rab7 在含 MTB 吞噬体中的共定位，也显著诱导 LAMP 的共定位，且这种共定位可被 p38 和 PI3K 抑制剂显著降低。用 pH 敏感的 LysoTracker 染料监测含 MTB 的晚期吞噬体与溶酶体的融合，发现 REA 处理的感染 BMDMs 中酸性染料 LysoTracker blue 被质子化并被困在酸化的细胞器中。由此可见：REA 可增强吞噬体酸化和溶酶体融合。

4.REA 增加 MTB 感染的 BMDMs 中细胞内钙和活性氧（ROS）的产生

使用 Fluo-4/AM 检测发现，REA 处理后 MTB 感染的 BMDMs 中细胞内钙浓度短暂升高，5 分钟达到峰值后下降。钙螯合剂 BAPTA 预处理可抑制 REA 诱导的 EEA-1 共定位、PI3K 和 p38 磷酸化，并消除 REA 介导的 MTB 生长抑制。REA 处理的细胞中 ROS 定位升高，细胞上清液中 NO 产生增加，NOX 酶抑制剂 DPI 和 ROS 清除剂 NAC 可降低 ROS 定位和 REA 介导的 MTB 生长抑制。这些实验结果表明：REA 可增加细胞内钙和 ROS 的产生，且吞噬体成熟与吞噬细胞 NADPH 氧化酶产生的 ROS 或吞噬体与溶酶体的融合有关。

5.REA 诱导卓越的保护效力

研究人员通过多种实验评估 REA 的保护效力。在体外实验中，T 细胞被 REA 处理的 DCs 和巨噬细胞激活后，表现出更强的 Th1/Th17 反应，细胞因子水平显著升高，对 MTB 感染的 BMDMs 内细菌生长抑制作用更显著。在体内实验中，用 REA 免疫小鼠后，再用 MTB H37Ra 或 H37Rv 菌株攻击，发现 REA 免疫的小鼠在感染后 16 周，肺部和脾脏中的细菌载量降至检测不到的水平，这一结果得到了肺组织大体和病理检查以及抗酸染色的支持。REA 免疫小鼠的肺和脾细胞在感染后 6 周和 16 周仍能显著抑制 MTB 在 BMDMs 内的生长。多功能 T 细胞分析显示，REA 免疫小鼠在感染后 6 周和 16 周，肺中 REA 特异性 IFN-γ+IL-2+TNF-α+ CD4+ T 细胞水平较高，16 周时脾脏中该细胞水平也较高。此外，REA 免疫小鼠肺部巨噬细胞呈现 M1 极化，且这种极化在 16 周时仍持续存在。综合体内外实验得出：REA 激活的 DCs 和巨噬细胞可有效激活具有杀菌活性的 T 细胞，REA 诱导的保护免疫与抗原特异性多功能 IFN-γ+IL-2+TNF-α+ CD4+ T 细胞、组织中产生 IL-2 和 IL-17 的长效 T 细胞以及 M1 巨噬细胞极化有关。

研究结论与讨论

本研究开发的 REA 融合蛋白通过树突状细胞成熟诱导 Th1 和 Th17 反应，并通过 PI3K-p38 MAPK-Ca2+-NADPH 氧化酶途径促进吞噬体成熟，增强骨髓来源巨噬细胞对 MTB 的杀伤作用。在小鼠模型中，REA 疫苗展现出前所未有的保护效力，感染 16 周后可将细菌生长抑制到检测不到的水平。其保护机制涉及激活具有强大杀菌活性的 T 细胞，促进 M1 巨噬细胞极化，并维持组织中的 Th1 和 Th17 反应。REA 的卓越保护效力与抗原特异性多功能 IFN-γ+IL-2+TNF-α+ CD4+ T 细胞以及组织中产生 IL-2 和 IL-17 的长效 T 细胞相关。

与其他结核病疫苗候选物相比，REA 的优势明显。许多结核病疫苗候选物在小鼠模型中未能清除感染，而 REA 实现了细菌载量降至检测不到的水平。BCG 虽为唯一获批疫苗，但在成人中的保护效力差异大，REA 在小鼠模型中的保护效力优于 BCG。此外，REA 作为亚单位疫苗，成分明确，分子量比 Rv2299c-Ag85B-ESAT6 降低约 30kDa，更便于纯化，在疫苗生产方面具有优势。

然而，REA 要成为临床可用的疫苗仍面临挑战。需要在更多动物模型中验证其效力，进行全面的安全性评估，还需进一步研究其保护机制，确定与保护相关的生物标志物。尽管如此，REA 在消除 MTB 感染方面的显著效力为其作为下一代结核病疫苗的开发提供了有力依据，有望替代或增强 BCG 疫苗接种，为全球结核病防控带来新的曙光。