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为解决结核病疫苗保护效果不稳定的难题，韩国研究人员开发了新型融合蛋白疫苗Rv2299cD2D3-ESAT-6-Ag85B（REA）。该研究通过激活树突细胞（DCs）成熟和巨噬细胞PI3K-p38 MAPK-Ca2+-NADPH氧化酶通路，诱导Th1/Th17免疫应答，在小鼠模型中实现结核分枝杆菌（MTB）的完全清除。这项发表于《npj Vaccines》的成果为开发高效结核疫苗提供了新策略。
结核病（TB）仍是全球最致命的传染病之一，每年导致超130万人死亡。尽管卡介苗（BCG）已使用百年，但其对成人肺结核的保护率波动在0%-80%之间。更严峻的是，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）能通过抑制吞噬体成熟、阻断抗原呈递等机制逃避免疫清除。当前进入临床试验的疫苗候选物如H56、GamTBvac等均未能实现感染完全清除，揭示传统以T细胞抗原为核心的疫苗设计存在局限性。
韩国忠南大学医学院Hwa-Jung Kim团队在《npj Vaccines》发表突破性研究，通过分子工程构建新型三组分融合蛋白REA（Rv2299cD2D3-ESAT-6-Ag85B）。该疫苗创新性地整合了热休克蛋白家族成员Rv2299c的免疫增强域与经典T细胞抗原ESAT-6、Ag85B，在小鼠模型中首次实现MTB感染16周后肺部和脾脏细菌负荷降至检测限以下。
研究采用多学科技术方法：通过流式细胞术分析抗原呈递细胞（APCs）表面标志物；利用共聚焦显微镜追踪吞噬体-溶酶体融合过程；采用特异性抑制剂阻断PI3K/p38 MAPK/Ca2+信号通路；通过ELISA和细胞内细胞因子染色评估免疫应答；使用H37Rv和H37Ra菌株建立小鼠攻毒模型评估保护效力。
REA诱导APCs活化
研究发现REA以剂量依赖性方式促进骨髓来源树突细胞（BMDCs）分泌IL-12和TNF-α，上调MHC-II、CD80/CD86表达。通过OT-II TCR转基因T细胞共培养实验证实，REA处理的BMDCs可驱动Th1/Th17极化，其效率与LPS刺激相当但避免IL-4过度产生。在巨噬细胞中，REA激活PI3K-AKT-GSK-3β和MAPK通路，促进NF-κB核转位。
REA抑制MTB胞内生长
REA处理的巨噬细胞对MTB的杀伤效率显著高于单一组分（P<0.001）。机制研究表明，REA通过以下级联反应促进杀菌：① 30分钟内快速磷酸化I型PI3K，招募hVPS34至吞噬体，增加早期内体抗原EEA1的定位（28.44±2.44 vs 对照组<15）；② 持续激活p38 MAPK，驱动Rab5向Rab7转化；③ 增强LAMP1与溶酶体标记物LysoTracker的共定位，该效应可被PI3K抑制剂LY2940029完全阻断。
钙信号与ROS调控
Flou-4/AM检测显示REA使胞内Ca2+浓度5分钟内达峰，激活NADPH氧化酶产生ROS。使用钙螯合剂BAPTA或ROS清除剂NAC处理后，REA的杀菌效应降低50%（P<0.01），证实Ca2+-ROS轴是关键调控节点。
协同免疫保护
REA激活的DCs与巨噬细胞共培养时，产生IFN-γ、IL-17水平较单一APC处理组提高3倍（P<0.001）。小鼠实验显示，REA免疫组在H37Rv攻毒16周后肺组织抗酸染色（AFB）阴性， granuloma面积减少67%（vs BCG组）。免疫组化揭示该保护与M1型巨噬细胞（iNOS+/CD163-）持续极化相关，其M1/M2比值较对照组高4.8倍（P<0.0001）。
长效免疫记忆
多功能CD4+ T细胞（IFN-γ+IL-2+TNF-α+）在肺组织中的比例较BCG组高12倍，且抗原特异性IL-17应答可持续至感染后16周。值得注意的是，REA将Rv2299c分子量缩减30kDa但保护效果反升，揭示D1结构域去除优化了抗原呈递效率。
该研究突破传统疫苗设计范式，首次证明通过协同激活先天免疫（DCs/巨噬细胞）与适应性免疫（Th1/Th17）可彻底清除MTB。REA诱导的三大保护特征——持续M1极化、多功能T细胞应答及吞噬体成熟通路激活，为开发"sterilizing immunity"级结核疫苗奠定基础。未来需在非人灵长类模型中验证该策略，并探索其与BCG的联用方案。这一发现不仅对结核病防控具有重大意义，也为其他胞内病原体疫苗研发提供了新思路。
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