基于Simple Western毛细管免疫分析技术实现多聚谷氨酰胺疾病中突变与野生型蛋白的精准定量

针对多聚谷氨酰胺疾病（polyQ）治疗研发中传统Western blot（WB）技术通量低、重复性差的问题，VICO Therapeutics团队开发了基于Simple Western（SW）毛细管免疫分析的高效定量方法，成功建立了HTT、ATXN1/2/3、ATN1和AR蛋白的检测体系，并创新性利用caspase 3酶切实现HTT突变/野生型亚型分离。该研究为polyQ蛋白靶向疗法的临床前筛选提供了标准化工具，发表于《Molecular Neurobiology》。

多聚谷氨酰胺疾病的精准定量技术突破
多聚谷氨酰胺疾病（polyQ）是一类由CAG三核苷酸异常扩增导致的神经退行性疾病，包括亨廷顿舞蹈症（HD）、脊髓小脑共济失调（SCA1/2/3/6/7/17）等9种类型。这些疾病的共同特征是突变蛋白中多聚谷氨酰胺链（polyQ）的异常延长，引发毒性增益功能。尽管降低突变蛋白水平是潜在治疗策略，但传统Western blot（WB）存在耗时长、重复性差等问题，严重制约药物研发效率。

VICO Therapeutics的研究团队在《Molecular Neurobiology》发表研究，开发了基于Simple Western（SW）毛细管免疫分析的高通量定量技术。通过筛选41种抗体，优化出针对HTT、ATXN1/2/3、ATN1和AR蛋白的检测方案。创新性利用caspase 3酶切HTT蛋白生成含polyQ域的N端片段，首次实现全长HTT（≥348 kDa）突变/野生型的分离定量。

关键技术方法
研究采用患者来源成纤维细胞系（Coriell Institute），通过siRNA敲降验证抗体特异性，使用Wes/Jess系统进行SW分析。针对HTT开发了caspase 3酶切结合66-440 kDa分离模块的方案，并通过抗体稀释和蛋白负载梯度实验确定各检测体系的线性范围。

研究结果
ATXN1检测体系
抗体16H8L13在66-440 kDa模块中检测到115 kDa野生型（WtATXN1）和130 kDa突变型（MtATXN1），siRNA敲降效率达86%。12-230 kDa模块则无法区分亚型。

ATXN3高灵敏度检测
抗体ab221143在12-230 kDa模块中实现52 kDa野生型与70 kDa突变型的完全分离，信噪比>1400，线性范围0.05-0.6 mg/mL。

HTT定量突破
全长HTT无法直接分离亚型，但经caspase 3处理产生的N端片段（N-WtHTT~56 kDa，N-MtHTT>59 kDa）在GM09197（18/175 CAG）细胞中显示250 kDa条带，CAG长度与迁移率呈正相关。

讨论与意义
该研究建立的SW检测体系将单次分析时间从WB的数天缩短至3小时，蛋白需求降低10倍。尤其对HTT的酶切策略为临床前药物筛选提供了突变体特异性定量方案。尽管ATXN7、TBP等蛋白因抗体限制未成功开发，现有体系已覆盖80%的polyQ疾病靶点。未来可拓展至iPSC神经元等模型，推动精准医疗发展。

研究同时揭示了SW技术相较于WB的三大优势：1）避免转膜变异，2）自动峰识别提升重复性，3）兼容96孔板高通量筛选。这些发现为神经退行性疾病的生物标志物开发和治疗评估树立了新标准。