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本研究揭示了转铁蛋白受体(TfR)通过招募VPS34复合物I促进磷脂酰肌醇3-磷酸(PI(3)P)合成，进而调控自噬体形成与闭合的双重机制。研究发现TfR经MARCH8泛素化后结合VPS15，产生的PI(3)P不仅通过招募WIPI2启动自噬，还通过招募ESCRT蛋白VPS36介导自噬体闭合。这一发现为理解自噬过程的时空协调提供了新视角，并为相关疾病治疗提供了潜在靶点。
转铁蛋白受体调控自噬体形成与闭合的双重机制
Highlights
• 转铁蛋白受体(TfR)通过招募VPS15调控PI(3)P合成
• TfR依赖的PI(3)P同时控制LC3脂化和自噬体闭合
• PI(3)P招募ESCRT蛋白VPS36促进自噬体闭合
• 内吞过程中pH下降促使铁从转铁蛋白释放，激活TfR-VPS15结合
Summary
自噬体形成涉及多个需要协调的连续步骤。研究发现哺乳动物细胞中，转铁蛋白受体(TfR)将LC3家族脂化（自噬体生物发生的早期步骤）与后续的自噬体闭合过程联系起来。TfR缺失会损害自噬流，而其过表达则以铁不依赖的方式刺激这一分解代谢过程。TfR在RAB11A-LC3B阳性膜上被泛素连接酶MARCH8泛素化，这些膜是LC3家族成员脂化的位点，也是吞噬泡的起源。泛素化的TfR招募VPS34组分VPS15，使新生自噬体膜上合成磷脂酰肌醇3-磷酸(PI(3)P)。这种PI(3)P不仅对LC3脂化重要，还对后续吞噬泡闭合至关重要，此时TfR依赖的PI(3)P招募运输所需的内体分选复合物(ESCRT)。这种TfR活性发生在含铁转铁蛋白内吞后，因为只有在内体区室pH降低导致铁从转铁蛋白解离后，TfR才能结合VPS15。
Introduction
巨自噬（简称自噬）是一种进化保守的机制，最终导致多余或潜在危险的胞质蛋白和细胞器的溶酶体降解。自噬体从称为吞噬泡(PH)的开放双膜结构演化而来。PHs在磷脂酰肌醇3-磷酸(PI(3)P)和RAB11A（循环内体标记）招募WIPI2后形成，WIPI2是与ATG5-12/ATG16L1复合物相互作用的蛋白，该复合物将ATG8/LC3家族成员连接到PH膜上，使LC3-I（游离LC3）转化为LC3-II（脂质结合的LC3），这是自噬体形成的关键步骤。LC3-II水平与细胞中自噬体体积相关。
LC3-II阳性吞噬泡是从循环内体发出的指状结构，包裹着待降解的底物。然后，"指状"之间的开口被运输所需的内体分选复合物(ESCRT)组分关闭，这是一组通常需要反向拓扑膜切割的蛋白质亚复合物。闭合的自噬体通过动力蛋白2从RAB11A区室释放。目前尚不清楚自噬体生物发生的各个步骤如何联系，以及LC3脂化是否与自噬体闭合功能相关。
自噬体从管状-囊泡循环内体演化可以解释为什么自噬体具有双膜，为什么内吞的转铁蛋白和转铁蛋白受体的胞外域存在于PHs/自噬体的内外膜之间，以及为什么内吞的转铁蛋白与LC3B在指状自噬前体中共定位。由于内层自噬体膜与隔离的自噬内容物一起降解，这种膜相关TfR也至少部分通过自噬降解。
TfR是一种普遍表达的跨膜糖蛋白，通过受体介导的转铁蛋白(Tf)相关铁的内吞作用将铁输入细胞。铁负载的Tf（全铁转铁蛋白）与TfR结合并通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。在细胞内，Tf被运输到早期内体(EEs)，pH降低导致全铁转铁蛋白释放铁，同时仍与TfR结合（变为脱铁转铁蛋白）。然后，Tf被定向到循环内体返回细胞表面，释放到循环中。红细胞前体中TfR缺失会导致贫血，这是由于铁摄取减少导致其发育失败。然而，TfR敲除似乎不影响许多非造血组织的发育，其配体Tf的缺失与细胞内铁水平增加有关。此外，小鼠肠上皮细胞中TfR的选择性敲除导致与铁摄取无关的严重表型，表明其非经典功能。
Results
TfR过表达诱导自噬
为测试TfR是否调控自噬，研究人员过表达野生型(WT)TfR，导致自噬体标记LC3-II积累，这与细胞自噬体体积/数量相关。由于TfR过表达在营养充足培养基（基础条件）和用溶酶体抑制剂巴佛洛霉素A1(Baf)处理的细胞中都增加了自噬体数量，这些数据表明自噬体/LC3-II生物合成增加。此外，Tf结合受损的TfR-RGD突变体也像WT TfR一样正向调控自噬体形成，表明这一TfR功能是铁不依赖的。TfR沉默5天降低了有无Baf时的LC3-II水平，表明自噬体生物合成受损。
为进一步表征TfR在自噬中的作用，研究人员使用HaloTag-LC3自噬体完成实验，该实验通过膜不通透和膜通透性HaloTag配体区分开放/未闭合PHs、新生（闭合）自噬体(Au)和成熟自噬体及自溶酶体(MAu)。TfR沉默5天的细胞在基础条件和Baf处理下显示自噬结构总数减少，且自噬体和成熟自噬体数量减少。形成的少数结构是开放的PHs。
TfR过表达增加了基础和Baf条件下总成熟自噬体/自溶酶体(MAu)的数量。TfR过表达降低了自噬能力细胞(ATG5+/+或ATG16+/+)中Q74聚集体（由突变亨廷顿蛋白片段形成，其聚集百分比与表达水平相关）的细胞百分比，但在自噬缺失细胞(ATG5-/-, ATG16-/-)中没有。Sequestosome 1(p62/SQSTM1)是另一个公认的自噬底物。使用稳定表达HaloTag-p62的HeLa细胞系（以避免扰动对p62转录的影响），发现TfR过表达强烈降低HaloTag-p62水平。因此，TfR过表达诱导功能性自噬。
LC3与RAB11A阳性自噬体膜的连接由ATG16L1/ATG5-12泛素样复合物介导，其位置由其相互作用蛋白WIPI2决定。先前研究表明WIPI2通过结合PI(3)P和RAB11A被招募到RAB11A阳性循环内体上。TfR过表达增加了PI(3)P点数量（使用4xFYVE可视化PI(3)P）和与LC3相关的PI(3)P量。这种PI(3)P与TfR和RAB11A相关。TfR沉默降低了基础和血清剥夺条件下PI(3)P点数量。类似地，WIPI2点在血清剥夺条件下(饥饿)在TfR敲低后减少。
为验证TfR在这些自噬体生物发生早期步骤中的作用，研究人员使用双分子荧光互补(BiFC)监测WIPI2在RAB11A区室上的招募。制作了WIPI2-RAB11A Split Venus，通过比较RAB11A与WT WIPI2和不能结合RAB11A的WIPI2 YI120AA突变体（阴性对照）的相互作用进行验证。TfR耗竭强烈消除了基础和血清剥夺条件下的BiFC信号。通过重新表达TfR完全恢复了信号。这些数据表明，泛素化TfR通过结合VPS15的UIM刺激自噬体生物发生，使VPS34复合物I形成和PI(3)P合成，以在循环内体上招募WIPI2，这是LC3连接所需的步骤。
VPS15与TfR相互作用
蛋白质组学分析揭示VPS15(PIK3R4)是潜在的TfR结合伴侣。VPS15是VPS34复合物的组成部分，使自噬体膜上形成PI(3)P。哺乳动物VPS34复合物I（调控自噬早期事件）包括VPS34(PIK3
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