基于NS1缺陷的牛源H5N1禽流感病毒clade 2.3.4.4b减毒活疫苗的研发与保护效力研究

为解决高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1 clade 2.3.4.4b在奶牛中的跨物种传播及人畜共患病风险，美国德克萨斯生物医学研究所等团队开发了一种NS1蛋白缺陷的减毒活疫苗（LAIV）LPhTXdNS1。该疫苗以低致病性牛源人流感病毒A/Texas/37/2024 H5N1为骨架，通过删除NS1基因并修饰HA蛋白裂解位点实现安全减毒。单次鼻内免疫即可诱导强效免疫应答，完全保护小鼠抵御致死性野生型病毒攻击，为高危人群（如农场工作者）提供了紧急防控新策略。

论文解读

背景：危机四伏的跨物种威胁

2024年3月，高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1 clade 2.3.4.4b基因型B3.13在美国奶牛场暴发，首次证实该病毒可感染反刍动物并引发牛至人传播事件。截至研究时，全球累计报告70例人感染病例（含1例死亡），凸显其大流行风险。尽管季节性流感疫苗对禽流感病毒存在有限交叉保护，但其有效性仅30–67%，且无法诱导黏膜免疫。现有减毒活疫苗（LAIV）因使用1957–1960年的内部基因骨架，与流行株匹配度低，在成人中免疫原性不足。因此，开发针对新型牛源H5N1的高效疫苗迫在眉睫。

研究设计与方法

德克萨斯生物医学研究所（Texas Biomedical Research Institute）领衔的研究团队利用反向遗传学技术，以低致病化处理的牛源人流感病毒A/Texas/37/2024 H5N1（LPhTX）为骨架，删除其非结构蛋白NS1基因（关键毒力因子），构建出NS1缺陷型疫苗候选株LPhTXdNS1（图1a）。研究通过以下核心实验验证其潜力：

1. 体外减毒验证：在Vero细胞中比较LPhTXdNS1与亲本株（LPhTX）的复制能力（空斑试验、生长曲线）及干扰素抑制功能（IFN-β启动子报告系统）；

2. 小鼠安全性评价：鼻内接种不同剂量（10²–10⁴ PFU）后监测存活率、体重变化及组织病毒载量（鼻甲、肺、脑）；

3. 免疫原性分析：血凝抑制（HAI）抗体检测及肺部细胞因子/趋化因子表达（多重液相芯片技术）；

4. 攻毒保护实验：免疫28天后以致死剂量野生型H5N1（HPhTX-Nluc）攻击，通过活体成像（IVIS）、组织病毒滴度及病理学评估保护效果。

关键结果与发现

1. LPhTXdNS1的减毒特性与免疫激活能力

• NS1缺失的分子证据：Western blot证实LPhTXdNS1感染的细胞不表达NS1蛋白（图1b），纳米孔测序显示NS1基因完全删除（图1c）。

• 复制缺陷：在Vero细胞中，LPhTXdNS1的峰值滴度较亲本株低12–30倍（图1g）；在表达IFN-β启动子的MDCK细胞中，因无法抑制干扰素通路，其感染引发强烈GFP和荧光素酶信号（图2）。

• 安全性优异：感染小鼠无死亡或体重下降（图3c,d），肺脑组织病毒载量显著降低（图3e,f），且病理损伤和病毒抗原阴性（图5,6）。

2. 单剂免疫即可诱导强效保护

• 抗体应答：所有剂量组均产生高滴度HAI抗体（图3b），其中10³–10⁴ PFU组抗体水平可持续4周。

• 先天免疫激活：高剂量组（10⁴ PFU）感染后2天显著上调IFN-β、IL-6和CCL2（图4），但未引发持续炎症。

• 完全攻毒保护：单剂免疫后，小鼠抵御致死性HPhTX-Nluc攻击的存活率达100%（10³–10⁴ PFU组），肺部无病毒复制（图7,8），且抑制了细胞因子风暴（图9）。

3. 病理学验证保护机制

攻毒后对照组小鼠肺部出现37%的病理损伤和7%病毒抗原阳性（图10c,d），而免疫组损伤≤1%（图11）。脑部检测显示免疫组无病毒侵袭（图10e），证实疫苗阻断系统性感染。

结论与意义

本研究成功构建了首个针对牛源H5N1 clade 2.3.4.4b的NS1缺陷型LAIV LPhTXdNS1。其核心优势在于：

1. 安全性突出：NS1的完全缺失（非截短）避免毒力回复，限制其在免疫细胞中的复制；

2. 高效便捷：单次鼻内接种即可激发黏膜、体液与细胞免疫，克服现有LAIV在成人中的免疫原性不足；

3. 广谱潜力：为应对禽流感病毒跨物种传播提供了快速疫苗开发模板，可扩展至家禽和奶牛防控。

该成果发表于《npj Vaccines》，不仅为高危职业人群（如兽医、农场工作者）提供了紧急防护手段，更推动LAIV技术从季节性流感向新发人畜共患病防控的跨越。未来需进一步评估多剂次策略、哺乳动物模型（如雪貂）效力及对异源亚型的交叉保护，加速临床转化。