基于生物正交发光探针BLGLN实现活体肿瘤ASCT2介导谷氨酰胺摄取的实时追踪

本文开发了一种创新性生物正交发光探针系统BLGLN，通过斯陶丁格连接反应（Staudinger ligation）实现了对活体肿瘤中ASCT2（SLC1A5）介导的谷氨酰胺（Gln）摄取的实时监测。该系统由膜通透性D-荧光素衍生物BL568和叠氮修饰的谷氨酰胺模拟物AA201组成，可在肿瘤细胞内特异性释放D-荧光素并产生生物发光信号，克服了传统LC-MS/PET技术的样本破坏性、操作复杂性等局限，为肿瘤代谢重编程研究和ASCT2靶向治疗开发提供了新型工具。

探针设计原理

研究团队针对肿瘤"谷氨酰胺成瘾"现象，聚焦主要谷氨酰胺转运体ASCT2（SLC1A5）设计生物正交探针BLGLN。该系统创新性采用斯陶丁格连接反应，包含两个核心组分：1）被2-二苯基膦苯甲酸保护的D-荧光素衍生物BL568，可被动扩散进入细胞；2）叠氮修饰的谷氨酰胺模拟物AA201，能通过ASCT2特异性转运。分子对接显示AA201完美复刻天然谷氨酰胺与ASCT2的关键结合模式，包括与Gly430、Ser353的氢键相互作用。

合成与优化

BL568通过酯缩合反应合成，经RP-HPLC纯化后通过¹H/¹³C/³¹P-NMR和HRMS验证结构。AA201采用两步法合成，相比另一候选分子AA263具有更优的水溶性和稳定性。细胞实验证实BL568在50 µM、AA201在100 µM时均无显著细胞毒性，为后续应用奠定安全基础。

体外验证体系

建立稳定表达荧光素酶的HCT116细胞系后，优化实验参数显示：1）信号在14分钟后达到稳定平台期；2）信号强度与AA201浓度呈线性相关（R²=0.9208）；3）检测灵敏度达5 µM。与LC-MS方法对比，BLGLN能准确反映ASCT2抑制剂V9302处理后的谷氨酰胺摄取变化趋势。特异性实验发现，虽然ATB^0,+可少量转运AA201，但ASCT2仍是主要转运体，该结论通过抑制剂处理（V9302/GPNA）和siRNA敲低实验获得双重验证。

动态监测突破

反向抑制实验生动展示了BLGLN的实时监测能力：当移除竞争性抑制剂谷氨酰胺后，肿瘤细胞的AA201摄取能力在20分钟内快速恢复，生物发光信号迅速升至对照组水平。这种动态监测能力为研究肿瘤代谢适应性提供了前所未有的时间分辨率。

活体成像应用

在HCT116-Luc裸鼠移植瘤模型中，瘤内注射BL568后3小时给予AA201，可观察到显著的肿瘤部位特异性发光信号增强（p<0.05），而V9302预处理组则完全抑制该信号。这种无创成像方式克服了传统¹⁸F/¹¹C标记PET探针的放射性缺陷，首次实现活体水平ASCT2功能的实时光学评估。

转化医学价值

该研究突破现有技术三大局限：1）避免复杂样本前处理；2）实现分钟级时间分辨率；3）支持从单细胞到活体的多尺度检测。作为首个特异性监测ASCT2转运活性的光学探针，BLGLN不仅为肿瘤代谢研究提供新工具，更为ASCT2靶向药物的高通量筛选建立了标准化平台。未来通过优化探针药代动力学特性，有望推动肿瘤代谢诊疗一体化发展。