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本研究针对CRISPR-Cas系统介导的DNA整合过程中修复机制不可控的难题，通过深度学习模型inDelphi预测微同源（μH）介导的修复模式，开发了基于μH串联重复修复臂的精准整合策略。该技术实现了HEK293T细胞中32个位点的精确整合，并在非洲爪蟾和小鼠神经元中完成生殖系可遗传整合及内源蛋白标记，同时通过优化设计单链寡核苷酸（ssODN）模板实现无痕单/双碱基编辑。研究提供的Pythia设计工具为实验和基因治疗应用提供了通用解决方案。
基因组编辑技术CRISPR-Cas9虽已广泛应用，但其介导的DNA整合仍面临修复过程不可控的挑战。传统同源定向修复（HDR）依赖长同源臂且仅适用于增殖期细胞，而非同源末端连接（NHEJ）和微同源介导末端连接（MMEJ）常导致基因组-转基因边界不可预测的缺失或插入，可能破坏邻近基因功能。临床数据显示，20-25%致病性序列变异源于微缺失，这些突变多呈现典型的3bp局部微同源特征。如何利用这种天然修复机制实现精准整合，成为基因编辑领域的关键瓶颈。
瑞士苏黎世大学（University of Zurich）和比利时根特大学（Ghent University）的研究团队在《Nature Biotechnology》发表的研究中，首次将深度学习模型inDelphi应用于外源DNA与基因组断裂界面的修复预测。研究发现，在CRISPR-Cas9诱导的双链断裂（DSB）处添加与切割位点侧翼序列匹配的μH串联重复（如5×3-bp μH），可使修复过程遵循序列上下文特异性规则。通过设计包含μH串联重复的修复臂，研究人员在HEK293T细胞中实现32个基因位点的精准整合，效率较NHEJ提升1.8倍，且83%的读段显示基因组无缺失。在非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）胚胎中，该技术成功完成h11安全港位点的生殖系整合（效率0.5-1%）及myh9、acta2等内源蛋白的荧光标记；在成年小鼠脑中，μH修复臂使神经元Tubb2a基因的框内标记效率提升4.8倍。研究进一步开发Pythia算法，通过计算左右修复臂长度的联合概率，指导ssODN模板设计实现单碱基精准编辑，在爪蟾酪氨酸酶（tyr）基因中实现3.2%的无痕点突变。
关键技术包括：1）利用inDelphi模型预测250,000个人类染色体gRNA位点的μH修复模式；2）构建含PaqCI酶切位点的"PaqMan"质粒实现线性化DNA精准递送；3）通过流式细胞术和靶向扩增子测序定量整合效率；4）采用腺相关病毒（AAV）介导成年小鼠脑神经元编辑；5）开发Pythia矩阵预测ssODN修复模板的最优设计。
μH串联重复修复臂的设计原理
通过分析合成DNA的修复模式发现，在DSB右侧添加左侧3bp序列的串联重复，可使52%的修复转向μH介导的3bp缺失（图1a）。全基因组模拟显示，5次串联重复时μH使用率趋于稳定（图1b），且-4位点的鸟嘌呤（G）显著提升整合效率（图2e）。在AAVS1位点实验中，5×3-bp μH修复臂使73%的左边界和78%的右边界读段保持基因组完整（图1i-j）。
基因组与转基因的双向保护机制
相比传统NHEJ（基因组删除率>50%），4×3-bp μH修复臂将基因组删除率降至<17%，且66%的读段在两端均无缺失（图2c-d）。靶向32个非必需基因的实验证实，-4位为G的gRNA驱动整合效率达7%，显著高于A/T位点（2.2-2.8%）（图2k），且预测+1插入率<25%的位点效率提升2.2倍（图2l）。
跨物种应用验证
在爪蟾h11位点，4×3-bp μH修复臂实现CMV:eGFP的定向单拷贝整合（图3b-c），而6-bp μH将可靶向基因比例从16%提升至51%（图4a）。小鼠脑部实验中，μH修复臂使Tubb2a-eGFP框内标记占8.6%，显著高于NHEJ的1.8%（图5g-h）。
Pythia编辑系统的建立
通过计算修复臂长度与完美修复的联合概率（图6a），设计的ssODN在HEK293T中实现18%的eGFP-to-eBFP转换（r=0.77）（图6c-d）。针对人类RPE65基因的248个错义突变，预测81%可获Pythia评分>60（图6g），爪蟾tyr基因编辑验证了该预测的准确性（图6m-n）。
该研究揭示了外源DNA-基因组界面修复的确定性规律，建立的μH串联重复策略突破了HDR对细胞周期的依赖，为分裂后细胞和早期胚胎的基因编辑提供新工具。Pythia系统将深度学习拓展至ssODN设计领域，使单碱基编辑具有可预测性。提供的在线设计平台（pythia-editing.org）将促进该技术在基础研究和基因治疗中的应用，特别是需要保留阅读框的蛋白标记和临床突变修复场景。研究同时指出，DSB诱导的p53激活和潜在染色体异常仍是未来需解决的关键问题。
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