FOXP基因调控浦肯野细胞多样性及小脑形态发生的分子机制研究

这篇研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间蛋白质组学技术，揭示了FOXP转录因子家族（Foxp1/Foxp2/Foxp4）在小脑浦肯野细胞（PC）亚型分化和空间模式形成中的核心作用。研究发现，Foxp1+ PC亚型是小脑半球发育的关键调控者，其缺失导致半球结构缺陷，而跨物种比较表明该亚型在人类中显著富集，提示其在认知功能进化中的潜在意义。

摘要

小脑浦肯野细胞（PC）作为小脑皮层唯一的输出神经元，其功能多样性对运动协调、学习和神经环路形成至关重要。然而，PC异质性的分子基础及其发育调控机制长期未明。本研究通过整合单细胞转录组（scRNA-seq）和三维空间蛋白表达分析，首次在胚胎小鼠小脑中鉴定出11种分子特征明确的PC亚型，并揭示其空间分布模式可预测成年小脑的纵向条纹结构。

Main

胚胎期PC亚型的分子特征与空间定位

研究团队利用scRNA-seq技术对E16.5和E18.5小鼠小脑进行分析，通过Foxp2表达筛选出PC群体，进一步聚类识别出11个亚型（PC1-PC11）。这些亚型表现出独特的转录特征：PC1高表达Foxp1和Zfhx4，定位于小脑最外侧；PC11缺乏Foxp2但表达Foxp4和Calb1，特异性分布于绒球小结叶。值得注意的是，亚型间差异基因显著富集于钙黏蛋白超家族（如Pcdh10、Cdh22），提示细胞表面黏附分子可能参与PC的空间排布。

为解析亚型的三维分布，研究者开发了scANKRS技术——通过循环免疫荧光（CycIF）对连续切片进行50种蛋白标记，结合计算对齐重建三维结构。结果显示，PC亚型在胚胎期已形成明确的区域化分布：PC1-PC2位于表层，而PC3-PC5靠近脑室区，可能是迁移中的过渡态细胞。光片荧光显微镜（LSFM）验证了这些亚型被PC稀疏间隙（PC-sparse gaps）分隔，这些间隙从E14.5持续至出生后，可能作为谱系限制边界。

FOXP基因的协同调控机制

Foxp1/Foxp2/Foxp4的组合表达定义了PC亚型特征。条件性敲除实验显示：

1. 1.

   功能层面：En1^cre介导的Foxp2单等位基因缺失即可显著减少幼鼠超声发声（USV），而Foxp1缺失同样导致USV缺陷，但小脑核神经元特异性敲除无此表型，提示PC是主要效应细胞。

2. 2.

   形态学层面：Foxp1-cKO小鼠出现旁绒球小叶异常分支；Foxp2-cKO小鼠中央叶缩小而绒球小结叶扩大；双敲除则导致小脑半球几乎完全缺失。免疫染色显示，Foxp2缺失后，下橄榄核的主橄榄（PO）和背侧副橄榄（DAO）神经元发生渐进性凋亡，与其投射靶区（半球PC）的丧失相呼应。

分子机制上，scANKRS分析揭示Foxp2缺失导致PC1和PC7亚型减少、PC9和PC11扩增。三维重建显示，突变体中PC9簇间距缩短，原本分隔亚型的PC稀疏间隙消失。这些变化精准预测了成年突变体的Aldoc⁺/Plcb4⁺条纹异常——野生型中旁蚓部和小脑半球的交替条纹在突变体中融合为单一Plcb4⁺区域。

跨物种比较与进化意义

通过分析人类胎儿小脑scRNA-seq数据，发现PC1/PC4（外侧小脑相关）比例显著高于小鼠，而PC6（中线相关）减少，与人类半球扩张的解剖特征一致。鸡胚研究则显示：Foxp1⁺ PC样细胞数量稀少且滞留于PC层下方，不同于哺乳动物的皮层整合模式。EdU标记实验证实其异常定位源于内在迁移特性，而非出生时间差异。

讨论

该研究建立了PC亚型分子特征-空间定位-功能模块的关联框架：

1. 1.

   发育机制：FOXP蛋白通过形成异源二聚体（如Foxp1/Foxp2）组合调控亚型特异性基因程序，其缺失导致模块化连接错误（如下橄榄核神经元靶向性丧失）。

2. 2.

   临床关联：FOXP1/FOXP2突变相关自闭症谱系障碍（ASD）可能部分源于小脑半球模块缺陷，这与ASD患者小脑半球功能异常报道相符。

3. 3.

   进化启示：Foxp1⁺ PC在哺乳动物中的扩增可能是小脑参与高阶认知功能的细胞基础。

未来研究可进一步探索：① PC亚型如何特异性招募颗粒细胞和橄榄核神经元形成功能模块；② FOXP组合编码如何调控突触可塑性；③ 非人灵长类中PC1亚型的进化动态。该成果为小脑发育疾病提供了新的分子靶点，并重新定义了皮层模式形成的理论框架。