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本研究开发了一种新型单向毫流体多器官芯片（MOoC）系统，成功模拟了慢性阻塞性肺疾病（COPD）中肺与肠道之间的器官间通讯。研究发现，香烟烟雾提取物（CSE）和尼龙微塑料纤维刺激的肺上皮细胞（A549）通过释放半乳糖凝集素-3（Galectin-3）等损伤相关分子模式（DAMPs），诱导结肠直肠细胞（DLD-1）产生促炎反应（IL-6表达升高）和屏障完整性破坏（E-cadherin和ZO-1蛋白 delocalization）。该模型为研究多器官间通讯提供了创新平台，对理解COPD全身性并发症机制具有重要意义。
引言
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种由长期吸入有毒气体和颗粒引起的严重肺部疾病，其特征包括气道炎症（慢性支气管炎）和肺泡组织破坏（肺气肿）。除肺部病变外，COPD患者常伴随肺外合并症，表现为全身性炎症和双向肺-肠轴激活。近年来研究表明，超过半数COPD患者会出现心血管疾病、骨质疏松或代谢综合征等合并症，且其发病率远超年龄、吸烟或社会经济地位所能解释的范围。尤其值得注意的是，COPD患者发生炎症性肠病和胃溃疡等胃肠道疾病的风险显著增加。
器官间通讯主要通过细胞释放到血液中的因子实现，包括细胞因子、趋化因子、microRNA、细胞外囊泡和损伤相关分子模式（DAMPs）等。在COPD中，肺上皮细胞暴露于香烟烟雾、尾气颗粒或微塑料等可吸入污染物时，会大量分泌这些通讯介质。其中，肺-肠轴是COPD中研究最为深入的器官间通讯范例。临床观察发现COPD患者存在肠道通透性增加和肠道微生物群改变，而口服益生元和益生菌可通过诱导肠-肺通讯改善COPD症状，表明肺与肠道之间存在双向通讯。
然而，由于缺乏合适的体外模型来研究器官间通讯，COPD中器官间通讯的具体机制仍不清楚。传统研究多局限于队列研究和炎症因子检测，难以进行功能性研究。为此，本研究开发了一种新型多器官芯片（MOoC）系统，专门用于研究受刺激肺细胞与结直肠细胞之间的器官间通讯。
材料与方法
细胞培养与处理
研究使用人肺泡癌上皮A549细胞和人结直肠腺癌DLD-1细胞。细胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO2条件下培养。香烟烟雾提取物（CSE）通过将无滤嘴研究香烟烟雾气泡通入无血清RPMI-1640培养基制备，使用前稀释至20%或40%浓度。尼龙微塑料纤维（中位尺寸12×31μm）按先前描述的方法制备成工作浓度。
多器官芯片系统构建
MOoC系统基于最近开发的开源毫流体气道芯片模型进行重新设计，包含两个100mm2细胞培养室，培养室高度1mm，培养基体积100μL。采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作芯片，通过铂固化硅胶管连接两个培养室，连接管体积约7μL。整个系统包括注射泵、气泡陷阱和收集容器，垂直放置于定制支架中以排除气泡。
实验方案
为研究可吸入污染物暴露的肺上皮细胞与结直肠上皮细胞间的通讯，A549细胞和DLD-1细胞分别接种于MOoC系统的两个培养室中。细胞在静态条件下培养24小时贴壁后，以150μL/h流速培养2天形成单层。随后，A549细胞用CSE（20%-40%）或10,000根尼龙微塑料纤维在无血清培养基中刺激4小时，而DLD-1细胞同时用无血清培养基处理。刺激后，用5mL无血清培养基充分冲洗去除残留刺激物。最后，两个培养室连接形成MOoC系统，继续以150μL/h流速培养24小时。
检测方法
细胞活性采用钙黄绿素AM（活细胞）、碘化丙啶（死细胞）和Hoechst（细胞核）染色评估。细胞外双链DNA（dsDNA）水平使用PicoGreen荧光dsDNA试剂盒检测。半乳糖凝集素-3水平使用人半乳糖凝集素-3DuoSet ELISA试剂盒测量。
基因表达通过qRT-PCR分析，使用特异性TaqMan引物-探针组检测PPIA、CXCL8、IL-6和CDH1基因表达。免疫荧光染色检测E-cadherin和ZO-1蛋白的表达和定位，使用CellProfiler软件进行亚细胞染色分析。
结果
MOoC系统的构建与验证
成功开发的新型毫流体多器官芯片（MOoC）系统包含两个100mm2细胞培养室，可单独使用或串联连接形成培养基流动。连接后，所有分泌因子以150μL/h流速从第一个培养室流向第二个培养室，使第二个培养室中的细胞持续暴露于这些因子。将人肺上皮A549细胞和人结直肠DLD-1细胞分别培养于两个培养室中，连接24小时后显微镜检查显示细胞无形态学改变或死亡率增加，表明DLD-1细胞能够耐受未刺激A549细胞分泌因子的暴露。
可吸入污染物诱导通讯介质释放
为研究香烟烟雾和微塑料暴露是否导致肺上皮细胞释放长效可溶性因子并影响结直肠细胞，A549细胞在MOoC系统中暴露于CSE（20%-40%）或10,000根尼龙微塑料纤维。4小时刺激后充分冲洗去除CSE或微塑料纤维，然后将两种细胞在MOoC系统中连接24小时。活死染色显示，20%CSE或微塑料暴露不会诱导A549细胞死亡，但40%CSE暴露会增加死亡细胞数量。与CSE/微塑料刺激的A549细胞连接的DLD-1细胞未出现死亡。
dsDNA水平检测显示，与CSE/微塑料刺激的A549细胞连接的DLD-1细胞流出液中dsDNA水平未增加，表明CSE或微塑料暴露未诱导显著的坏死性细胞死亡相关DAMP释放。然而，半乳糖凝集素-3水平检测发现，与微塑料刺激的A549细胞连接的DLD-1细胞流出液中半乳糖凝集素-3水平显著高于与未刺激A549细胞连接的对照组。这些结果表明肺上皮细胞暴露于微塑料可触发可溶性通讯介质的释放。
污染物暴露的肺细胞诱导结直肠细胞促炎反应
通过qPCR分析可吸入污染物暴露对结直肠细胞促炎和上皮屏障基因表达的影响。对照实验显示，与预先用CSE或微塑料处理的无细胞芯片连接的DLD-1细胞中，CXCL-8、IL-6或CDH1基因表达均无显著变化。
A549细胞暴露于CSE或微塑料后，CXCL8表达未受显著影响，但40%CSE暴露后IL-6表达呈升高趋势，尼龙微塑料暴露则显著提高IL-6表达。此外，40%CSE暴露的A549细胞CDH1表达降低。
将DLD-1细胞与预处理的A549细胞连接后，与CSE刺激的A549细胞连接的DLD-1细胞IL-6表达增加；与微塑料刺激的A549细胞连接的DLD-1细胞不仅IL-6表达升高，CDH1表达也呈下降趋势。由于DLD-1细胞本身未直接暴露于CSE或微塑料，这些结果表明肺上皮细胞暴露于可吸入污染物可触发可溶性因子的释放，诱导结直肠细胞产生促炎反应并降低屏障基因表达。
为验证这些效应是否由A549细胞分泌因子引起，用重组人半乳糖凝集素-3刺激DLD-1细胞。与器官间通讯实验结果一致，IL-6表达增加，但CXCL8或CDH1表达无变化。
污染物暴露降低结直肠细胞屏障完整性
为进一步研究上皮屏障完整性，评估了与可吸入污染物暴露的肺细胞连接的结直肠细胞中粘附连接和紧密连接蛋白E-cadherin和ZO-1的定位变化。在未暴露的A549细胞中，E-cadherin呈现清晰且定位明确的膜染色模式，ZO-1信号略有分散但仍主要定位于膜上。CSE刺激（一定程度上包括微塑料）可破坏这两种蛋白的表达模式：E-cadherin在细胞质和细胞膜上的表达均减少；ZO-1表达在细胞膜上发生特异性改变—40%CSE降低ZO-1表达，而微塑料增加细胞膜上的ZO-1表达。
在与未刺激A549细胞连接的DLD-1细胞中，E-cadherin和ZO-1均呈现清晰的膜定位染色。与40%CSE刺激的A549细胞连接（一定程度上包括微塑料）可改变DLD-1细胞中E-cadherin和ZO-1的表达：40%CSE和一定程度上的微塑料使细胞质和细胞膜上的E-cadherin表达降低；40%CSE使细胞质和细胞膜上的ZO-1表达增加。这些结果证实，肺上皮细胞暴露于香烟烟雾或微塑料不仅影响肺上皮屏障完整性，还会触发可溶性因子的释放，破坏结直肠细胞的屏障完整性。
讨论
本研究首次建立了适用于通过可溶性循环介质研究器官间通讯的毫流体多器官芯片系统。利用该模型，评估了肺上皮细胞暴露于CSE或微塑料纤维是否导致信号传递至肠道上皮细胞。研究表明，暴露于可吸入污染物的肺细胞可与结直肠细胞通讯，诱导后者产生促炎反应并降低屏障完整性。
实验中，肺上皮细胞暴露于CSE或微塑料可诱导促炎反应和屏障完整性降低，这与既往研究一致。微塑料对A549细胞的影响研究较少且结果不一：有研究表明聚苯乙烯纳米塑料可诱导A549细胞产生促炎反应，也有研究报道A549细胞对聚苯乙烯纳米塑料完全无反应。本研究发现，尼龙微塑料纤维暴露可使半乳糖凝集素-3释放增加四倍。半乳糖凝集素-3是一种众所周知的器官间通讯介质，从细胞释放后可诱导促炎反应。
研究表明，与CSE/微塑料刺激的A549细胞连接的结直肠细胞通过IL-6表达升高和E-cadherin、ZO-1表达定位改变，产生促炎反应并丧失屏障完整性。大鼠和小鼠模型研究曾显示香烟烟雾暴露可导致肠道屏障完整性降低和肠道炎症发生，吸烟COPD患者中也观察到类似的肠道健康影响。
实验中，A549细胞暴露于CSE尤其是尼龙微塑料纤维可诱导DAMP半乳糖凝集素-3的释放。用重组人半乳糖凝集素-3刺激DLD-1细胞可增加IL-6表达，这与DLD-1细胞与CSE/微塑料刺激的A549细胞连接时观察到的效应一致。然而，半乳糖凝集素-3可能并非肺与结直肠细胞间器官通讯的唯一责任因子，多种其他因子可能也参与了观察到的器官间通讯效应。
本研究开发的MOoC系统为研究器官间通讯提供了创新平台。相较于传统的细胞共培养模型，MOoC系统可精确控制通讯方向；相较于条件培养基转移模型，MOoC系统以150μL/h的恒定流速确保细胞持续、稳定地暴露于分泌因子，更接近体内生理状态。该系统的开源特性、低成本和大规模细胞培养面积（100mm2）使其易于在各种实验室环境中实施，并可获得足够数量的生物样本用于多种生物学检测。
总结而言，本研究开发了一种开源MOoC模型，可用于研究不同细胞类型通过释放因子进行的通讯。研究发现，污染物暴露的肺上皮细胞释放的因子可诱导结直肠上皮细胞炎症和屏障完整性降低，这些特征在COPD患者中也常见到。该研究为理解COPD中肺-肠轴机制及胃肠道COPD合并症的发生提供了重要信息。
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