细胞外囊泡递送CRISPR系统沉默去势抵抗性前列腺癌中雄激素受体的基因治疗新策略

本研究针对CRISPR基因编辑技术在疾病治疗中面临的递送难题，开发了一种基于细胞外囊泡（EVs）的Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）递送平台，成功沉默去势抵抗性前列腺癌（CRPC）细胞中的雄腺激素受体（AR）基因，显著抑制肿瘤细胞增殖，为CRPC治疗提供了新型可编程治疗策略。

前列腺癌是全球男性最常见的恶性肿瘤之一，而进入去势抵抗阶段的前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）更是临床治疗的难点。尽管雄激素受体（androgen receptor, AR）信号通路已被证实是CRPC发生和发展的核心驱动机制，现有AR靶向药物（如恩杂鲁胺）仍面临耐药问题。基因编辑技术CRISPR/Cas9的出现为直接沉默AR基因提供了全新思路，然而如何高效、安全地将CRISPR组分递送至肿瘤细胞内部，一直是限制其临床转化的关键瓶颈。

为解决上述问题，Chenming Ye等人在《Molecular Therapy》发表的研究中，开发了一种基于细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的递送系统，用于运输Cas9蛋白与单链引导RNA（sgRNA）形成的核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合物，实现对AR基因的高效沉默，并显著抑制CRPC细胞增殖。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用基因工程手段对Cas9蛋白进行N-豆蔻酰化修饰以增强其向EVs的富集；从细胞培养上清中分离并纯化EVs；通过体外细胞实验和耐药细胞模型评估AR基因编辑效率及功能效应；使用染色质可及性测定技术分析不同细胞系编辑效率差异的机制。所有细胞实验均基于经典前列腺癌细胞系（如22Rv1、LNCaP等）及其恩杂鲁胺耐药衍生株。

CRISPR RNP的EVs封装策略优化

研究人员首先对Cas9蛋白进行N端豆蔻酰化修饰（myristoylation），该修饰显著提高了Cas9/sgRNA RNP复合物被包装进入EVs的效率。实验证明，经过工程化改造的EVs可有效将RNP递送至前列腺癌细胞，并在细胞内实现靶向基因编辑。

AR基因编辑的效率与机制

研究显示，该递送系统能够在多种前列腺癌细胞中引入AR基因位点的插入/缺失突变（indels），成功沉默外源及内源性AR的表达。值得注意的是，编辑效率因细胞系而异，研究人员发现这与靶点区域染色质可及性（chromatin accessibility）的差异密切相关。

功能影响与表型分析

尽管AR基因的mRNA水平在编辑后未发生显著变化，但其下游基因（如KLK3、FKBP5等）的表达明显受到抑制，表明CRISPR编辑主要影响了AR蛋白的功能或稳定性。进一步功能实验表明，EVs递送的RNP显著抑制了前列腺癌细胞的增殖能力，尤其在恩杂鲁胺耐药细胞中仍保持强烈抑制效果。

耐药细胞中的治疗效果

在恩杂鲁胺耐药CRPC模型中也观察到一致的结果：EVs介导的RNP递送不仅成功引入AR基因突变，还有效阻断了肿瘤细胞的增殖途径，表明该策略有望克服现有AR靶向药物的耐药问题。

本研究通过建立EVs介导的CRISPR/Cas9 RNP递送平台，实现了对前列腺癌关键驱动基因AR的高效沉默，显著抑制了肿瘤细胞增殖，并在恩杂鲁胺耐药模型中仍保持抗肿瘤活性。该策略不仅为CRPC提供了潜在的可编程治疗新方案，也为CRISPR系统在体内的递送难题提供了解决思路。值得注意的是，该研究还揭示染色质结构可能是影响CRISPR编辑效率的关键因素之一，这为优化基因编辑治疗策略提供了重要理论依据。综上所述，这项研究在技术方法创新与机制探索层面均具有重要价值，为推进CRPC的基因治疗进入临床实践奠定了坚实基础。