淋巴结固有特性使其在免疫学上易受转移：调节性T细胞通过限制IL2抑制CD8+ T细胞杀伤能力

本文揭示淋巴结（LN）作为免疫器官却易发生肿瘤转移的悖论，提出独立于肿瘤预处理的固有机制：调节性T细胞（Treg）通过竞争性消耗IL2，抑制CD8+ T细胞产生颗粒酶B（GZMB）、穿孔素等细胞毒性分子，从而削弱其杀伤功能。研究发现LN内Treg与CD8+ T细胞空间邻近性显著高于原发肿瘤，导致抗原性肿瘤细胞在LN中特异性免疫逃逸。该研究为LN转移提供新靶点，提示IL2定向疗法或可改善淋巴结转移治疗。

摘要

淋巴结（LN）作为抗肿瘤免疫的关键场所，却表现出对转移性 colonization 的高度易感性，这一现象构成免疫学悖论。传统观点认为肿瘤来源的外源性因子通过诱导免疫抑制状态预处理引流LN，从而促进肿瘤细胞存活。本研究通过多种免疫活性移植模型证明，LN具备独立于预处理的固有特性，使其成为肿瘤细胞逃避T细胞控制的优势场所。机制上，LN中调节性T细胞（Treg）通过限制IL2可用性，局部抑制肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的细胞溶解能力，从而促进肿瘤生长。这些发现为实体瘤中LN转移高发率提供了固有机制解释。

引言

免疫系统功能在淋巴、血液和组织间分区化。细胞溶解性CD8⁺ T细胞在人类淋巴中相对于血管内循环代表不足，这种免疫活性的空间分区可能对转移（肿瘤相关死亡的主要原因）产生影响。区域淋巴结是实体瘤细胞扩散的最常见部位，其受累情况在大多数肿瘤类型中作为重要预后指标（即临床分期）。LN转移可能通过直接播种和耐受性 conditioning 促进癌细胞进一步扩散，但LN同样负责抗肿瘤免疫的建立。这些事实的并置创造了一个悖论：LN如何既能作为免疫监视的主要场所，又易受早期转移？

肿瘤特异性CD8⁺ T细胞在LN中缺乏细胞溶解效应表型

通过流式细胞术分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血（PB）、肿瘤引流LN（tdLN）和原发肿瘤（PT）中分离的CD8⁺ T细胞，发现来自PB或PT的CD8⁺ T细胞产生高水平的细胞溶解效应分子颗粒酶B（GZMB）和穿孔素，而来自tdLN的细胞缺乏这些分子。利用头颈鳞癌（HNSCC）患者的质谱流式数据集进一步分析显示，初始细胞（CCR7⁺CD45RA⁺）在tdLN中最常见，终末分化效应记忆细胞（CCR7⁻CD45RA⁺）在PB中最常见，效应记忆（T_EM；CCR7⁻CD45RA⁻）和驻留记忆细胞（CD103⁺CD69⁺）在PT中最常见。记忆（非初始）CD8⁺ T细胞显示 distinct 组织特异性表达模式并按组织部位聚类。特别是，来自tdLN的CD8记忆细胞显示最高水平的干细胞样和记忆标志物（TCF1、CD27和CD127）表达，而来自PB的细胞显示最高GZMB产生，来自PT的细胞显示与耗竭（PD1、TIM-3和CD39）和组织驻留（CD69和CD103）相关的标志物最高表达。

重新分析黑色素瘤特异性（Melan-A/MART1-tetramer⁺）CD8⁺ T细胞的基因表达数据集发现，从PB单核细胞（PBMC）分离的细胞高表达编码效应分子（FGFBP3、GNLY、KLRG1和PRSS23）的基因，而肿瘤浸润LN（TILN）中的细胞高表达涉及组织保留（CXCL13和ITGA1）的基因，低表达涉及组织出口（S1PR1和S1PR5）的基因。同样，与TILN中的细胞相比，PB中的黑色素瘤特异性CD8⁺ T细胞富含细胞毒性和效应功能特征。

为了评估肿瘤特异性CD8⁺ T细胞反应在血液和LN区室的动力学，研究使用表达模型抗原卵清蛋白（OVA）的Lewis肺癌（LLC）细胞，并在LLC-OVA肿瘤植入前将naïve、OVA特异性OT-I T细胞过继转移到同系不同系的小鼠中。纵向流式细胞术分析显示，在所有时间点（第7至45天），PB中活化（CD44⁺）的OT-I T细胞产生高水平的细胞溶解分子GZMA和GZMB。与之对比，tdLN中活化的OT-I T细胞缺乏这些分子的产生，除第9至11天的一个小峰值外。活化OT-I T细胞在tdLN中细胞溶解产生减少在其他肿瘤类型中同样保守，包括表达OVA的乳腺（EO771-OVA）、结肠（MC38-OVA）和胰腺癌（6694c2-OVA）系的皮下肿瘤，以及胰腺癌的 orthotopic 模型。活化OT-I T细胞在tdLN中细胞溶解潜力减弱并非由于PT的局部免疫抑制 conditioning，因为活化OT-I T细胞在 contralateral LN（不共享肿瘤淋巴引流）中细胞溶解分子产生同样低。

在急性时间点（第11天），所有效应分化状态的OT-I T细胞在血液中循环时比在tdLN中产生更高水平的GZMA、GZMB和穿孔素。虽然短寿效应细胞（SLEC；CD127⁻KLRG1⁺）仅限于血液循环，但早期效应细胞（CD127⁻KLRG1⁻）和记忆前体效应细胞（CD127⁺KLRG1⁻）在血液中与tdLN对应物相比显示增加的细胞溶解分子产生。到肿瘤植入后45天，细胞溶解分子产生仅限于PB循环或肿瘤浸润的OT-I T细胞，而在tdLN中缺失。T_EM（CD44⁺/CD62L⁻）、中央记忆（T_CM；CD44⁺CD62L⁺）和干细胞样记忆（T_SL；TCF1^hiSLAMF6^hi）种群在此时间点建立。与之前研究一致，虽然T_CM和T_EM细胞在所有区室中都存在，但T_SL细胞在tdLN中最普遍。循环在PB或浸润肿瘤的T_CM和T_{EM细胞比tdLN中的细胞产生更高水平的GZMB和GZMA。tdLN中OT-I T细胞相对于PB的细胞溶解分子产生缺陷在功能上显著，因为从tdLN分离的OT-I T细胞在体外杀死OVA表达肿瘤细胞的能力低于从血液分离的细胞。}

对于内源性T细胞，OVA肽SIINFEKL特异性的CD8⁺ T细胞可以用OVA_257–264 H-2K^b特异性 tetramer 识别。与过继转移OT-1 T细胞的结果相似，tetramer⁺ CD8⁺ T细胞在tdLN中显示较低的细胞溶解分子GZMB和LAMP1产生，尽管激活标志CD44和CD69高表达。有趣的是，tdLN中的tetramer⁺ CD8⁺ T细胞在体外刺激后产生效应细胞因子IFNγ的能力与PB中的细胞同样 competent。同样，从NSCLC患者tdLN分离的CD8⁺ T细胞比从PB或PT分离的细胞产生更高水平的IFNγ，表明tdLN中的CD8⁺ T细胞尽管相对无法产生细胞溶解分子，但仍保持产生效应细胞因子的能力。这些数据共同表明，循环肿瘤特异性CD8⁺ T细胞在小鼠和人类的一系列肿瘤中比其LN对应物更具细胞溶解性。

LN固有易受抗原性肿瘤细胞定植

至少两种机制可以解释肿瘤细胞在LN中逃避免疫破坏的能力。首先，PT对tdLN的预处理可能促进免疫逃避，如先前提出的。或者，鉴于LN中细胞溶解性CD8⁺ T细胞稀缺（与PB相比），LN可能提供固有优势位点供抗原性肿瘤细胞存活。为了区分这些可能性，进行有限稀释实验以量化肿瘤形成效率，通过解剖显微镜评估，在LN（ after direct injection of tumor cells into the inguinal LN）或肺（ after intravenous injection into the tail vein）中。由于这些小鼠先前未暴露于肿瘤细胞，这种方法消除了这些器官中任何一个被预处理的可能性。

测试了三种胰腺KPC/Y（Kras^G12D、Trp53^R172H、CrePdx和YFP）来源的肿瘤细胞系（6694c2、2838c3和6499c4）以及乳腺癌细胞系EO771和肺来源的LLC细胞系。为了确定适应性免疫压力如何影响注射到血液和淋巴区室后的植入效率，使用亲代和表达OVA版本的每种细胞系进行分析，并通过绘制细胞剂量对肿瘤形成频率来测量植入效率。所有五种亲代细胞系在静脉注射后以略高于LN注射的效率形成肿瘤，这种差异仅在一种细胞系（6499c4）中 statistically significant。这些细胞系的高度抗原性（OVA⁺）版本在所有条件下形成肿瘤的效率较低。然而，当使用抗原性细胞时，LN注射 confer 了比静脉注射高6至35倍的肿瘤形成优势，这种差异在所有五种细胞系中 statistically significant。LN注射也对OVA⁺细胞的植入 confer 了比皮下注射高2至5倍的优势，但对亲代细胞没有这种优势。有趣的是，当使用MC38结肠癌细胞系的亲代版本（表达显性新抗原）时，LN注射 confer 了比静脉注射的优势。这种优势在T细胞缺陷Rag knockout（KO）小鼠中进行注射时被无效化。

为了确保注射到LN的行为不会损害其 mounting 反应的能力，比较了经历直接注射的LN与未注射LN的抗肿瘤免疫反应。为此，将PBS注射到小鼠腹股沟LN，或保持未注射，然后形成将引流到相关LN的YUMM1.7-OVA肿瘤，并比较两组中肿瘤生长控制和肿瘤特异性CD8⁺ T细胞扩张。PBS注射到引流LN并未损害小鼠清除YUMM1.7-OVA肿瘤的能力，因为它们在两个队列中都被 rejected。此外，PBS注射到tdLN并未损害其扩张OVA-tetramer⁺ CD8⁺ T细胞的能力。因此，直接注射流体到tdLN并未损害免疫系统形成有效抗肿瘤反应的能力。

为了确定LN注射是否对T细胞启动有更 subtle 的影响，使用Nur77^GFP/OT-I小鼠，这些小鼠在 engagement 其T细胞受体（TCR）时瞬时表达GFP，在这种情况下特异性于OVA。将CellTrace Violet（CTV）标记的Nur77^GFP/OT-I细胞转移到同系不同系的小鼠中，然后将LLC-OVA细胞皮下、静脉或直接注射到LN中。3天后，>95%的注射细胞在所有部位都被激活（GFP⁺）和/或增殖（CTV稀释），LN注射导致最高的 combined 种群。引人注目的是，LN注射导致OT-I细胞扩张显著大于皮下或静脉注射，而不会导致耗竭标志物增加。因此，LN注射不会损害LN对抗原反应的能力，反而导致肿瘤特异性CD8⁺ T细胞激活相当于或优于皮下或静脉注射。

随着肿瘤随时间进展，很可能在转移性肿瘤细胞到达LN时已经形成了记忆T细胞种群。为了测试OVA⁺肿瘤细胞在LN中的生长优势是否延伸到具有抗肿瘤记忆的小鼠，通过形成皮下LLC-OVA肿瘤，切除它们，并等待额外的40天，生成具有 established memory to the LLC-OVA tumor 的小鼠。然后在这些小鼠中重复有限稀释分析，并在LLC-OVA细胞LN注射与静脉注射后测量肿瘤生长。为了包括 resident memory 种群的潜在作用，注射到切除肿瘤引流的LN中。在这种免疫记忆范式中，LN注射仍然 confer 了比静脉注射的肿瘤形成优势，后者 route 从未导致肿瘤。这些结果共同表明，LN的固有特性允许抗原性肿瘤生长尽管有 robust 抗肿瘤T细胞启动。

T细胞对淋巴性与血源性肺转移施加不同压力

为了确定抗原性肿瘤细胞在自发性转移模型中也是否能够 colonize LN，检查先前报道的同系克隆KPC/Y胰腺肿瘤细胞系库，以识别一种细胞系6694c2，其在 orthotopic 植入胰腺后显示高比率的血源性转移（肺）和淋巴转移（胰腺LN）。然后将这种细胞系转导以表达OVA-tdTomato，并评估每种 route 的转移频率。与先前报告一致，OVA⁺ KPC/Y细胞在免疫活性小鼠胰腺中很少生长而不失去抗原表达。因此，在肿瘤植入前1天给予CD4/CD8⁺ T细胞消耗抗体，以允许OVA⁺ PT形成并开始转移。

为了比较T细胞对每种 route 转移的相对影响，T细胞消耗然后要么持续实验 duration，要么停止以允许T细胞恢复，随后量化对OVA⁺转移到肺（血源性扩散）或LN（淋巴扩散）的影响。持续T细胞消耗导致转移频率近似细胞系的亲代版本。部分T细胞恢复（即停止T细胞消耗后）将血源性转移到肺的频率降低三倍（从70%到23%），与针对经历血源性扩散的细胞的强T细胞反应一致。相比之下，T细胞恢复对转移到胰腺LN的频率没有影响（两组均约25%）。这些结果表明，肺的血源性 route 比淋巴 route 更好地受到T细胞保护。

为了确定人类癌症中淋巴和血源性转移效率是否与肿瘤抗原性相关，寻找一个临床数据集，其中肿瘤抗原性可以 isolated 为变量，并且可以在规模上比较血源性和淋巴转移的比率。为此，使用纪念斯隆凯特琳-转移事件和趋向性（MSK-MET）数据集，其中包含基因组信息以及数千患者转移位置的注释。专注于结直肠腺癌，其中基因组特征可预测地告知肿瘤抗原性。具体来说，结直肠腺癌可以分为微卫星稳定（MSS）和微卫星不稳定（MSI）疾病，其中MSI已知更具抗原性，并以增加的CD8浸润和更好的免疫治疗反应为特征。发现MSI评分和总突变负荷（TMB）与结直肠腺癌转移负相关，表明增加的抗原性可能在这种 setting 限制转移。与TMB和MSI评分的负相关对于转移到肝脏和肺（血液循环是 obligate route）最强，对于转移到 distant LN最弱。同样，虽然所有位置的转移在MSI患者中相比MSS患者减少，但转移到肝脏和肺的程度显著大于转移到区域或 distant LN。这些发现表明在结直肠腺癌中，抗原性可能限制血源性转移的程度大于淋巴转移。

Treg通过IL2限制抑制LN中肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的细胞溶解分子产生

抗原性肿瘤细胞尽管有 adequate T细胞启动仍在LN中生长的能力表明LN环境限制抗肿瘤T细胞的效应功能。由于观察到LN来源的CD8⁺ T细胞的细胞溶解特性和 killing capacity 相对于血液中的细胞减弱，假设免疫抑制细胞类型的局部效应可以解释这一点。为了确定LN中是否存在抑制性免疫细胞类型，评估了OT-I T细胞在tdLN中的GZMB产生， after transfer into recipient mice with varying immunodeficiencies。使用NOD-SCID小鼠（缺乏B和T细胞并有缺陷的NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞）、Rag1^KO小鼠（缺乏成熟B和T细胞）和muMT小鼠（缺乏B细胞）。在皮下注射6694c2-OVA细胞14天后，tdLN中活化（CD44⁺）OT-I细胞中的GZMB产生在NOD-SCID和Rag1^KO小鼠中显著高于C57BL/6和muMT小鼠。这些结果表明T细胞的一个子集可能负责抑制tdLN中的细胞溶解产生。这种活性的明显候选是Tregs，一个具有 well-established 免疫抑制功能的T细胞亚群。

为了测试Tregs负责抑制LN中细胞溶解特性获得的假设，使用Foxp3^DTR小鼠，其中二苯毒素（DT）给药选择性消融Tregs。将OT-I细胞过继转移到Foxp3^DTR小鼠中，随后1天皮下注射6694c2-OVA细胞，然后用DT或PBS对照处理小鼠6天 apart。在活化OT-I T细胞中，细胞溶解分子GZMB、GZMA和穿孔素的产生在Treg耗尽小鼠的LN中 greatly increased，导致这些细胞溶解分子的水平近似PB中存在的水平。

接下来探索了Tregs抑制CD8细胞溶解潜力的机制。TGFβ和IL10由Tregs分泌，可以 acts 抑制CD8⁺ T细胞；然而，在6694c2-OVA bearing 小鼠中阻断 either TGFβ or IL10并未恢复OT-Is在tdLN中的细胞溶解产生。Tregs可以通过高表达IL2受体α CD25来识别，这允许它们优先消耗游离IL2。由于Tregs不能产生IL2，它们的细胞因子消耗将其从其他免疫细胞中限制。这在像LN这样免疫细胞密度高且Tregs普遍的区域尤其如此。在Treg耗尽、6694c2-OVA bearing 小鼠中阻断IL2阻止了tdLN中OT-I细胞获得细胞溶解特性，表明Treg耗尽允许CD8⁺ T细胞通过保留IL2-rich环境获得细胞溶解活性。在胰腺中6694c2-OVA肿瘤的 orthotopic 模型中观察到类似结果。Tregs通过IL2限制限制KLRG1⁺ SLEC CD8⁺ T细胞的扩张。然而，LN中IL2依赖性获得细胞溶解产生并非仅仅 attributable to an expansion of SLECs，因为 both KLRG1⁺ and KLRG1⁻ OT-Is 依赖IL2增加GZMB和GZMA产生。

由于Tregs可以影响CD8⁺ T细胞启动，接下来确定这种机制是否也 accounts for the lack of cytolytic production among already primed memory populations of tumor-specific CD8⁺ T cells in the LN。为此，使用基于切除的肿瘤记忆模型使用LLC-OVA细胞系。在第47天用或不带IL2阻断的Treg耗尽 rechallenge 这些小鼠 with LLC-OVA tumors。Treg耗尽诱导记忆OT-I细胞中的细胞溶解分子产生，包括T_EM和T_CM细胞，并且对于这两种种群，这都是IL2依赖性的。Treg耗尽导致特定于tdLN的T_SL种群丢失，但 upon IL2 blockade在tdLN中恢复。用高剂量重组IL2（rIL2）处理模拟Treg耗尽，增加T_EM和T_CM细胞中的细胞溶解分子产生到 equivalent levels，并导致T_SL种群丢失。重要的是，rIL2处理 accomplished this尽管存在完整的Treg种群。这些结果共同表明，Tregs通过限制IL2 continuously suppress the acquisition of cytolytic properties by tumor-specific CD8⁺ T cells in the LN。

Tregs通过IL2隔离使肿瘤细胞在LN中存活 by Suppressing CD8⁺ T Cell Killing Capacity

接下来询问Treg对tdLN中CD8⁺ T细胞的抑制是否直接损害CD8⁺ T细胞杀死癌细胞的能力。为此，将OT-I细胞转移到Foxp3^DTR小鼠中，形成6694c2-OVA肿瘤，然后用PBS作为对照或DT处理小鼠以耗尽Tregs， with or without IL2 blockade。14天后，从这些小鼠的tdLNs中FACS分选OT-I T细胞，并与OVA⁺肿瘤细胞共培养。来自Treg耗尽tdLN的OT-I T细胞以几乎三倍于从PBS处理小鼠收获的细胞的效率杀死肿瘤细胞，这种方式完全依赖于体内预先暴露于IL2。这些数据表明，Tregs的IL2限制阻碍了tdLN中CD8⁺ T细胞杀死癌细胞的能力。

为了测试这种机制在人类癌症中是否保守，假设人类tdLNs暴露于IL2将增加tdLN来源的CD8⁺ T细胞的 killing capacity。为此，研究了来自经历研究 autopsy 的胰腺导管腺癌（PDAC）患者的tdLNs。将tdLNs切成小（2-4 mm）立方体以维持LN结构，并在实验前冷冻在-80°。取每个tdLN的部分进行组织学检查，并由 board-certified 病理学家确认非转移性。将tdLN立方体 thawed 并在补充有10% FBS、1% penicillin–streptomycin和1 ng/mL人IL-7的RPMI-1640中培养，并在37°C、5% O₂下孵育24小时。将100 IU/mL人IL2添加到实验tdLN立方体的培养物中。24小时后，将tdLN立方体 homogenized 成单细胞悬浮液并过滤，并使用阴性选择分离CD8⁺ T细胞。用LIVE/DEAD aqua fixable dye标记P815肥大细胞瘤靶细胞，并用抗CD3室温孵育30分钟。将CD8⁺ T细胞在96-well V-bottom板中与抗CD3标记的P815细胞在各种效应器:靶标比率下孵育4小时，存在被靶细胞摄取并在被GZMB cleavage时变得荧光的GZMB底物（GS）。然后洗涤细胞并用 annexin V–PE染色，并使用LSRII获取。通过减去靶标 only wells中 annexin V⁺TFL4⁺LIVE/DEAD⁻ P815细胞的频率来计算细胞溶解活性来自含有CD8⁺ T细胞的 wells中 annexin V⁺TFL4⁺LIVE/DEAD⁻ P815细胞的频率。通过减去靶标 only wells中 GS⁺TFL4⁺LIVE/DEAD⁻ P815细胞的频率来确定向靶细胞传递GZMB来自含有CD8⁺ T细胞的 wells中 GS⁺TFL4⁺LIVE/DEAD⁻ P815细胞的频率。

假设OVA⁺肿瘤细胞在LN中存活的能力取决于Treg依赖性通过IL2限制抑制CD8⁺ T细胞。为了测试这一点，将LLC-OVA细胞注射到Foxp3^DTR小鼠的LNs中，然后用PBS、DT + isotype、DT + anti-IL2或DT + anti-CD8处理小鼠。OVA⁺肿瘤仅从LN中清除 upon