随着全球气候变化问题日益严峻，减少化石燃料依赖、开发可持续的碳负排放技术成为21世纪的关键挑战。绿色甲醇因其原料来源广泛（如生物质、CO2和绿氢）、生产方式可持续且与现有基础设施兼容，被视为一种极具潜力的非粮食微生物发酵原料。然而，将工业模式微生物（如酿酒酵母）改造为能够高效利用甲醇的甲基营养菌株面临重大科学挑战，其中能量供应不足是制约其生长的核心瓶颈。
酿酒酵母作为重要的工业微生物，具备先进的蛋白质折叠修饰能力、成熟的基因编辑框架以及对苛刻发酵条件（如低pH和溶剂耐受）的卓越适应性。然而，关闭其糖酵解途径会导致即时能量失衡，造成ATP或NADH依赖的甲醇同化途径以及氨基酸、维生素等必需物质合成受阻，最终导致工程菌株生长缓慢、倍增时间长，并需要额外添加酵母提取物。尽管已有研究尝试通过引入异源途径或结合适应性进化来赋予酿酒酵母甲基营养特性，但效果仍不理想。
针对这一难题，西湖大学合成生物学与集成生物工程中心王亚杰团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员另辟蹊径，不再聚焦于引入异源的甲醇同化途径，而是通过为酿酒酵母装备一个高效的能源模块（异源MFF氧化途径），同时利用其自身固有的代谢能力，来提升甲醇同化效率。经过短暂的适应性实验室进化，他们成功获得了能量高效型甲基营养酿酒酵母菌株SC-AOX25。
为开展此项研究，团队主要应用了以下几项关键技术：通过CRISPR-Cas9系统进行精确的基因编辑以构建工程菌株；利用适应性实验室进化(ALE)策略筛选具有快速甲醇生长能力的突变体；采用13C同位素标记示踪技术结合液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析代谢通量；通过全基因组测序(WGS)和转录组测序(RNA-seq)鉴定关键突变和基因表达变化；使用透射电子显微镜(TEM)观察甲醛诱导的DNA-蛋白质交联(DPC)现象；并通过蛋白质组学分析DPC复合物中的蛋白质组成。
MFF氧化途径的构建与快速生长甲基营养酿酒酵母的获得
研究人员首先在酿酒酵母胞质中引入了两条不同的甲醇氧化途径：一条是依赖O2的途径，利用来自多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的醇氧化酶(Aox)及其激活剂丙酮酸羧化酶(Pyc1)将甲醇氧化为甲醛，并过表达过氧化氢酶(Cat)解毒H2O2；另一条是NAD+依赖的途径，利用来自甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)的甲醇脱氢酶(Mdh3)及其激活蛋白(Act1)。两条途径产生的甲醛均通过来自毕赤酵母(Pichia pastoris)的甲醛脱氢酶(Fld1)和S-甲酰谷胱甘肽水解酶(Fgh1)进一步氧化为甲酸，最终由来自多形汉逊酵母的甲酸脱氢酶(Fdh1)将甲酸氧化为CO2，构成完整的MFF氧化途径（图1a）。酶活测定证实了这些关键异源酶的功能性（图1b）。
初始工程菌SC-AOX0和SC-MDH0无法在以甲醇为唯一碳源的最小培养基(MM)中生长，可能源于甲醇毒性和缓慢的同化速率。通过对SC-AOX0进行两阶段适应性实验室进化(ALE)，研究人员最终从进化池中分离出单菌落SC-AOX25。该菌株在含10 g/L甲醇的MM中表现出优异的生长能力，最大比生长速率达到0.021 h-1（倍增时间33.0小时），最终OD600达到1.11，其生长性能和甲醇消耗量均优于此前报道的工程甲基营养酿酒酵母菌株（图1c-d）。
SC-AOX25中甲醇同化途径的解析
为了阐明SC-AOX25同化甲醇的代谢网络，研究人员进行了13C标记实验和转录组分析。结果表明，甲醇碳流通过三条内源途径被同化：磷酸戊糖途径(PPP)、乙醛酸-丝氨酸循环(GSC)和还原性甘氨酸途径(rGly)。其中，PPP主要负责同化甲醛，而GSC是甲酸同化的主要途径（图2, 图3）。体外酶活实验证实，转酮醇酶Tkl1和Tkl2能够催化甲醛和木酮糖-5-磷酸(Xu5P)生成磷酸二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(GAP)，为PPP途径同化甲醛提供了直接证据。通过比较基因敲除菌株的生长表型，发现GSC途径的关键基因ADE3的缺失会严重损害生长，而rGly途径的关键基因MIS1的敲除则无显著影响，进一步证实了GSC在甲酸同化中的主导作用。
能量模块的特征及其与甲醇同化的关联
研究人员推测，充足的能量供应是支持SC-AOX25甲基营养生长的关键。能量测定显示，SC-AOX25在甲醇培养基中产生的ATP水平显著高于在葡萄糖或葡萄糖加甲醇培养基中的水平，表明其甲醇发酵下的代谢效率得到增强（图4a-b）。通过全基因组测序和转录组分析，鉴定出几个关键的能量相关突变体：内源性甲酸脱氢酶Fdh1sc、发生突变的醇脱氢酶Adh2m和醇氧化酶Aoxm，以及一个功能未知的突变蛋白Rgi2m。基因敲除和回补实验表明，这些模块对于维持细胞内高水平的ATP/NADH、促进甲醇消耗和细胞生长至关重要（图4c-f）。动力学研究表明，Aoxm和Adh2m对甲醇的催化效率和特异性活性均高于野生型，从而增强了甲醇氧化效率。
CBB循环在工程甲基营养酿酒酵母中的实现
为了展示SC-AOX25作为C1同化平台的潜力，研究人员在其基础上引入了异源的卡尔文-本森-巴沙姆(CBB)循环，用于在甲醇发酵过程中固定CO2（图5a）。13C标记实验检测到了CBB循环特有中间物1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)的标记，证实了该途径的功能性运行（图5d-f）。引入CBB循环后，工程菌SC-AOX25-CBB的最终菌体密度和甲醇消耗量均有所提升，表明CO2的再固定增强了甲醇的同化效率（图5c）。
DNA-蛋白质交联问题
尽管SC-AOX25表现出增强的甲醇耐受性，但在发酵过程中仍会积累甲醛，导致DNA-蛋白质交联(DPC)的形成。透射电镜观察发现，随着培养进行和甲醇浓度升高，DPC现象加剧，形成网状结构（图6a）。蛋白质组学分析鉴定出超过500种交联蛋白，其中高丰度蛋白包括参与PPP、GSC途径以及ATP合成的关键酶（如Eno2, Pgk1等）（图6b-c）。这些DPC可能破坏了甲醇同化相关酶的活性，从而限制了菌体的进一步生长。
本研究成功构建了能量高效的甲基营养酿酒酵母SC-AOX25，该菌株能够通过异源MFF途径高效产生ATP和NADH，并利用其内源的PPP、GSC和rGly途径协同同化甲醇、甲醛、甲酸和CO2，实现了目前工程甲基营养酿酒酵母中最高的生长速率和菌体密度。研究不仅解析了酿酒酵母内源的甲醇同化网络，还鉴定出Fdh1sc、Rgi2m、Adh2m和Aoxm等关键能量模块，并揭示了甲醛毒性导致的DPC问题及其对生长的限制。通过引入CBB循环实现CO2共利用，进一步证明了SC-AOX25作为强大C1工程平台的潜力。该工作为优化C1底物定向生物制造平台提供了理论框架和技术支撑，对推动碳负排放生物技术的发展具有重要意义。未来，通过强化PPP和GSC途径的限速步骤、减轻甲醛/甲酸毒性以及利用进化中观察到的大片段基因重复，有望进一步提升该平台的甲醇利用效率。
