ER+/HER2−乳腺癌新辅助芳香化酶抑制剂敏感性的纵向单细胞多组学解析：免疫微环境与增强子重塑

雌激素受体（ER）阳性乳腺癌的治疗主要基于内分泌治疗。为解析ER阳性乳腺癌对芳香化酶抑制剂（AI）敏感性的机制，研究人员在新辅助治疗期间对25例患者的肿瘤活检样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫受体测序和增强子活性图谱分析。具有高ER信号传导以及ER结合位点增强子活性升高的恶性细胞对治疗敏感。耐药与雄激素受体（AR）信号传导、去分化和上皮–间质转化（EMT）相关。不良应答者在治疗压力下优先使用AR顺式调控组（cis-regulome）。基线肿瘤微环境（TME）与肿瘤降期相关。不良应答者表现出一种“热”但无效的免疫景观，富含初始淋巴样细胞和未分化髓样细胞。良好应答者显示活跃的免疫微环境，并伴有T细胞持续克隆扩增。研究人员的纵向单细胞分析阐明了驱动ER阳性乳腺癌对新辅助芳香化酶抑制敏感性和耐药性的遗传、细胞和表观遗传机制。

该研究发表于《Nature Genetics》。在背景上，ER⁺/HER2⁻（雌激素受体阳性/人表皮生长因子受体2阴性）乳腺癌约占乳腺癌的三分之二；系统治疗虽改善生存，但短期和长期复发仍值得关注。局部晚期ER⁺乳腺癌在化疗禁忌等情况下可接受新辅助内分泌治疗。既往研究提示ER与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号改变、远端调控元件如增强子上的表观修饰和转录因子（TF）结合，均影响ER⁺乳腺癌病理生理及治疗压力下的表型演化；ER⁺/HER2⁻肿瘤通常被视为“免疫冷”，但部分患者可能从免疫治疗获益，免疫微环境对预后和治疗反应的影响尚不明确。因此，研究人员围绕新辅助AI治疗期间ER⁺乳腺癌的敏感性/耐药机制，整合纵向单细胞转录组、T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）测序及增强子活性映射，发现耐药与AR信号、细胞去分化和EMT相关；高ER信号和干扰素反应与敏感性相关；基线TME与降期相关，不良应答者呈“热”但功能受损的免疫微环境，良好应答者呈T细胞持续克隆扩增；耐药细胞中AR结合位点增强子活性升高。该研究的意义在于从遗传、细胞和表观遗传层面阐明AI敏感性与耐药机制，为反应预测和免疫联合策略提供依据。

关键技术与样本来源：研究纳入随机、开放标签、患者内交叉NeoLetExe试验中25例局部晚期ER⁺/HER2⁻乳腺癌患者，采集基线、交叉（CO）和治疗结束（EOT）三时点共73份新鲜肿瘤活检。关键技术包括scRNA-seq、单细胞TCR测序（scTCR-seq）、单细胞BCR测序（scBCR-seq）；利用5′端scRNA-seq和SCAFE定位转录起始位点（TSS）并识别活性顺式调控元件（CRE）/增强子；用InferCNV推断拷贝数改变（CNA）；用milo进行差异丰度分析；用Unibind进行转录因子结合位点（TFBS）富集分析；以Prosigna进行PAM50分型和复发风险评分。

研究结果：
1）“Single-cell profiling of breast tumors during aromatase inhibition”：研究人员对25例患者三时点73份活检行scRNA-seq、scTCR-seq和scBCR-seq，质控后保留472,737个细胞，其中47,031个细胞获得可靠TCR、14,101个细胞获得可靠BCR；注释出12类细胞，包括乳腺肿瘤单细胞研究中已报道细胞及肥大细胞、中性粒细胞和脂肪细胞等罕见类型，建立纵向单细胞图谱。
2）“Clonal evolution and heterogeneity driven by copy number alterations”：通过InferCNV从scRNA-seq推断CNA，15.7%上皮细胞判为正常且比例随时间增加；恶性细胞按CNA以患者来源聚类，可见1q、16p扩增和13q22缺失等已知改变；20例患者可重建系统发育，检出4–8个克隆，克隆数从基线到EOT下降，提示治疗压力下瘤内异质性降低。
3）“Genomic and transcriptomic mechanisms of response and resistance”：通过追踪克隆大小动态，定义49个耐药克隆（基线至EOT比例增加）和60个敏感克隆（至少下降10倍）。敏感克隆富集3q26和10q11缺失（分别含PIK3CA、MAPK8），耐药克隆富集10q23缺失（含PTEN）、RAD51C和PARP1缺失及4q13扩增（含AREG、EREG和CXCL家族细胞因子）。转录组上，敏感克隆富集雌激素–ER信号及抗原呈递/干扰素反应基因，耐药克隆高表达ERBB2、CLU、MAPK13等；基因共表达聚类得到10个基因簇，其中簇6、7、8与ER信号相关，簇3、5与EMT/侵袭相关，簇2、4、9与去分化和AR信号相关；敏感克隆总体呈高ER信号、增殖和干扰素反应。
4）“Changes in the TME under treatment pressure”：用milo评估细胞类型随时间差异丰度，发现中性粒细胞、脂肪细胞和成纤维细胞增多，静息巨噬细胞和浆细胞减少，CD4⁺ T细胞下降；多数免疫细胞状态从基线到EOT减少而基质群体增多。研究人员将其解释为肿瘤负荷降低的后果，并与炎症消退和瘢痕组织形成相关。
5）“Poor responders have a less immune-reactive TME before treatment”：对10个临床病理变量和4个scRNA-seq衍生反应指标聚类，将患者分为良好应答者（GR）和不良应答者（PR）。基线时PR的TME看似免疫丰富，但显著富集初始CD4⁺ T细胞、初始B细胞和经典单核细胞等初始/未分化状态；GR成纤维细胞较多。基线TME细胞状态比例可区分GR与PR：LumA-GR呈较高基质细胞丰度，LumB-GR巨噬细胞浸润增加，LumB-PR单核细胞丰富且基线耐药克隆比例较高。LumB-GR恶性细胞干扰素通路活性高于LumB-PR，促炎巨噬细胞比例较高、单核细胞较少；髓系细胞丰度与恶性细胞干扰素评分相关。
6）“T cell clonotypes expand in good responders”：基于66份活检的高质量scTCR-seq数据，CD8⁺和CD4⁺效应记忆（EM）细胞具有最多独特克隆型和有效TCR，最大克隆型见于CD8⁺ EM和终末分化CD8⁺效应记忆（CD8 EMRA）状态。基线时PR的归一化平均克隆大小较低，GR的Shannon指数较低，提示GR基线TCR更呈克隆性、抗原驱动。纵向追踪显示GR中扩增和强扩增克隆型比例更高，PR中收缩克隆型比例更高；GR中单例克隆随时间增加而PR减少，提示GR持续招募新T细胞克隆。持续扩增与基线促炎巨噬细胞和EOT CD8 EM相关，持续收缩与初始CD4⁺ T细胞和经典单核细胞相关；BCR分析呈类似趋势但细胞数较少需谨慎。
7）“Active enhancers in single cells capture cellular identity”：利用5′端scRNA-seq在单细胞分辨率映射TSS，识别35,829个近端CRE（启动子）和99,996个远端CRE（增强子）；59%的增强子与至少一个scATAC-seq开放染色质区域重叠并富集ChromHMM注释增强子。增强子活性足以恢复细胞类型身份；TFBS富集分析显示不同谱系特征，如T/NK细胞富集GATA3、RUNX1，髓系富集CCAAT增强子结合蛋白（CEBP）。
8）“Enhancer activity sheds light on sensitivity and resistance to AI”：比较时间点差异活性增强子，基线较治疗中活跃者富集ESR1 TFBS，CO或EOT较基线活跃者富集AR结合位点。PR治疗中活跃增强子富集REST、NR3C1、FOXA1尤其AR，GR则富集RUNX1、GATA2、CEBPA。按克隆身份分析，耐药克隆治疗中活跃增强子富集AR TFBS。39%恶性细胞特异增强子同时含ESR1和AR TFBS，被称为激素感知增强子；PR中其比例从基线到EOT显著增加，GR中显著下降。GR治疗下激素感知增强子使用显著下降而PR不降，提示激素感知染色质的表观下调是敏感性关键机制之一。

讨论部分总结：基线TME可预测较好反应；PR呈无效免疫微环境，初始和未分化免疫细胞较多并伴T细胞克隆收缩，GR在新辅助治疗期间T细胞持续克隆扩增。Letrozole与exemestane两种序贯方案比较未见显著差异。研究人员将AR耐药发现与Hickey等研究视为互补：AI显著下调ER信号后，辅因子可用性可能向AR偏移，使AR结合ER原有顺式调控组并发挥促肿瘤作用；AR激动剂可能需要活跃ER信号才发挥抗肿瘤效应，而AR拮抗剂在ER信号降低或雌激素缺失时可能更有效。局限性包括粗针活检可能低估瘤内异质性和免疫微环境多样性，三时点采样较粗，新辅助期克隆动态未必代表长期耐药，且缺乏长期结局数据，不能判断EOT持续克隆与预后关系。研究结论（译）：研究人员提供并分析了局部晚期乳腺癌患者原发ER⁺/HER2⁻（LumA和LumB）肿瘤活检的纵向scRNA-seq、scTCR-seq和scBCR-seq数据集，患者在新辅助设置接受AI治疗。研究人员识别了AI敏感性和耐药的细胞、分子和表观遗传机制。通过表征治疗压力下存活恶性克隆的基因表达以及PR恶性细胞在EOT的活跃增强子，研究人员发现AR在AI耐药中具有关键作用。基线TME可预测更好反应。PR显示无效免疫微环境，初始和未分化免疫细胞水平较高，并伴T细胞克隆收缩；GR在新辅助治疗期间显示T细胞持续克隆扩增。Letrozole和exemestane在不同治疗臂中序贯给药，比较两臂未见显著差异。