脓毒症中巨噬细胞PANoptosis的上游调控机制
脓毒症是一种因宿主对感染免疫反应失调而危及生命的综合征，其特征包括过度炎症、炎性细胞死亡、免疫功能障碍及多器官衰竭进展。巨噬细胞在此过程中扮演关键角色，其通过激活包括焦亡、凋亡与坏死性凋亡在内的多种程序性细胞死亡（PCD）通路，加剧细胞因子释放与免疫稳态破坏。近年来提出的PANoptosis概念，指这些PCD通路通过名为PANoptosome的多蛋白复合体在功能上协同激活，形成一种整合性炎性细胞死亡程序。其中Caspase-8作为核心分子开关，整合上游信号以决定主导的细胞死亡方式：激活后可经Caspase-3/7启动凋亡，直接或间接通过Caspase-1切割GSDMD促进焦亡，并通过调节RIPK1与RIPK3抑制坏死性凋亡。尽管PANoptosis在脓毒症器官损伤中的作用已被证实，其上游调控机制仍不完全清楚。
NLK在脓毒症中表达升高并与PANoptosis基因及不良预后相关
为筛选PANoptosis的潜在上游调控因子，研究团队对脓毒症患者外周血单核细胞（PBMCs）的单细胞转录组数据集（GSE167363）与批量转录组数据集（GSE65682）进行分析。结果显示，与健康对照相比，脓毒症患者中Nemo样激酶（NLK）的表达显著升高。NLK高表达与28天生存率降低密切相关。进一步分析发现，NLK表达与PANoptosis通路中的关键效应分子（如MLKL、Caspase-3、IL-18）呈正相关。单细胞数据分析表明，在脓毒症状态下，多个免疫细胞谱系中NLK表达细胞比例增加，其中单核细胞是NLK表达细胞的绝对主要来源。尤为重要的是，仅在单核细胞群体内，NLK表达与PANoptosis执行基因（如ASC、CASP8、RIPK3、MLKL、NLRP3）构成的核心网络存在强特异性正相关。这为后续聚焦巨噬细胞PANoptosis的机制研究提供了依据。
NLK缺失减轻脓毒症模型器官损伤并提高生存率
为探究NLK在脓毒症中的功能，研究利用Csf1r-iCre驱动的髓系细胞条件性NLK敲除小鼠（NKO）构建盲肠结扎穿刺（CLP）脓毒症模型。与野生型（WT）小鼠相比，NKO小鼠在CLP后血清促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18）水平显著降低，7天生存率明显提高。组织病理学评估及器官功能指标（如肺湿/干重比、血清ALT、BUN、肌酐、cTnI等）检测均显示，NKO小鼠的肺、肝、肾、心脏等多器官损伤显著减轻。这些结果证实NLK缺失在脓毒症中能有效缓解全身炎症、多器官损伤并降低死亡率。
NLK缺失将脓毒症相关PANoptosis的执行转向坏死性凋亡
对CLP模型肺组织巨噬细胞的免疫荧光与免疫印迹分析显示，WT小鼠肺部巨噬细胞在脓毒症状态下同时激活了焦亡（GSDMD-N）、凋亡（cleaved Caspase-3）和坏死性凋亡（p-MLKL）标志物，呈现出典型的PANoptosis特征。透射电镜（TEM）也观察到了与三种死亡方式相关的超微结构特征。然而，在NKO小鼠中，焦亡与凋亡相关标志物表达显著减弱，而坏死性凋亡关键蛋白p-MLKL的表达与磷酸化水平却增强。TEM定量分析也显示NKO巨噬细胞中呈现坏死性凋亡超微结构特征的细胞比例增加。值得注意的是，这种死亡模式的转变并非源于巨噬细胞总数减少，因为WT与NKO小鼠肺中CD68+巨噬细胞总量在CLP后增加程度相当。相反，NLK缺失改变了巨噬细胞的功能表型，使其从CD68+CD86+（M1样）向CD68+CD163+（M2样）极化。鉴于Caspase-8在促进凋亡/焦亡并抑制RIPK1/RIPK3介导的坏死性凋亡中的核心作用，研究者推测NLK缺失导致的Caspase-8激活受损可能是触发此死亡模式转换的关键。
NLK促进Caspase-8活化并限制坏死性凋亡信号
机制探究发现，在WT巨噬细胞中，CLP或LPS刺激促进了Caspase-8的切割活化，并伴有适度的RIPK1和RIPK3磷酸化。而在NLK缺失的巨噬细胞中，Caspase-8活化显著减弱，但RIPK1/3磷酸化却显著增强。对调控PANoptosis的分子复合体进行分析，通过FADD的免疫共沉淀实验证实，在WT巨噬细胞中，炎症刺激能有效募集Caspase-8至FADD复合体并使其高效活化（表现为p18片段生成增加）。而在NLK缺失细胞中，Caspase-8向FADD复合体的募集部分保留，但其活化效率严重受损。与此同时，RIPK1免疫沉淀复合物中RIPK3与p-RIPK3的富集程度在NLK缺失细胞中增加，表明RIPK1–RIPK3坏死小体组装增强。此外，代表PANoptosome空间组装的ASC–Caspase-8共定位在NLK缺失细胞中也显著减少。这些结果说明，NLK能促进Caspase-8在PANoptosome相关复合体中的有效激活，同时限制RIPK1/3依赖的坏死小体形成。
NLK与Caspase-8的DED结构域互作以促进其活化
分子对接预测了NLK与Caspase-8之间存在潜在的高亲和力界面。免疫荧光与免疫共沉淀实验在体内外均证实，在LPS或CLP刺激下，NLK与Caspase-8发生相互作用并共定位。通过截短体突变实验进行结构域定位，发现NLK通过其中央非催化结构域（126–416位氨基酸）与Caspase-8的N端死亡效应结构域（DEDs，1–216位氨基酸）结合，该结构域正是Caspase-8通过同型DED-DED相互作用募集至FADD等衔接蛋白并发生近距离诱导二聚化与自切割的关键区域。为验证功能关联，研究在NLK缺失的巨噬细胞中过表达Caspase-8进行挽救实验。结果显示，Caspase-8过表达可部分恢复NLK缺失细胞中GSDMD-N和cleaved Caspase-3的生成，并适度抑制MLKL磷酸化。相应的Caspase-8与Caspase-3酶活性测定也得到一致结果。这表明NLK通过与Caspase-8的DED结构域结合，促进其在炎症刺激下的有效活化。
讨论与意义
本研究首次将NLK确立为脓毒症中Caspase-8依赖性PANoptosis信号的新型调控因子。NLK并非决定PANoptosis是否启动的开关，而是通过优化Caspase-8在已形成的PANoptosome中的募集与激活效率，充当一个调节死亡信号执行强度的“变阻器”。NLK缺失削弱了Caspase-8的活化，解除了其对坏死性凋亡的抑制，导致巨噬细胞死亡执行程序从混合性PANoptosis向以坏死性凋亡为主的模式转变。这种死亡模式的重编程改变了巨噬细胞的炎症输出（如减少IL-1β、IL-18等，增加CXCL10），重塑了局部免疫微环境，并最终在整体上减轻了细胞因子风暴、多器官损伤，提高了生存率。从临床转化视角看，脓毒症患者中NLK表达升高与不良预后相关，提示NLK–Caspase-8轴可能作为潜在的预后生物标志物与治疗靶点，为未来开发旨在“微调”而非全面抑制脓毒症中炎性细胞死亡的精准治疗策略提供了新思路。
