胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统中最具侵袭性和致死性的恶性肿瘤之一，其标准治疗方案（手术、放疗和化疗）的临床效果并不理想，患者中位生存期通常仅有15-18个月。造成这种治疗困境的一个主要“路障”是血脑屏障（BBB）。BBB由脑毛细血管内皮细胞通过紧密连接构成，能严格控制物质进出大脑，在保护中枢神经系统稳态的同时，也阻挡了绝大多数治疗药物进入脑部。然而，研究发现GBM能够重塑其周围的大脑微环境，将邻近的正常BBB改造成功能异常的血管系统，即血瘤屏障（BTB）。尽管BTB与BBB存在差异，但其形成的确切机制尚不完全清楚，这严重阻碍了能够有效穿透BTB、精准靶向GBM细胞的治疗策略的开发。
近年来，胞外囊泡（EVs）——一类由细胞释放的膜性囊泡——作为细胞间通讯的关键介质备受关注。GBM来源的EVs能够携带蛋白质、核酸等生物活性分子，穿梭至脑毛细血管内皮细胞，被认为在BBB向BTB的病理转化中扮演重要角色。为了深入解析这一过程并寻找新的治疗突破口，研究人员在《Journal of Extracellular Vesicles》上发表了一项重要研究，首次揭示了核仁素（Nucleolin, NCL）通过GBM-EVs的跨细胞转移是驱动BTB形成的关键机制，并基于此发现，创新性地设计出了能够穿透BTB、精准降解GBM细胞内靶蛋白的新型“智能”药物。
研究人员综合运用了多项关键技术来验证其科学假设。这包括：通过差速超速离心法从GBM细胞和正常星形胶质细胞中分离EVs，并利用纳米颗粒追踪分析、蛋白质组学等手段进行表征和差异分析；建立了体外BBB/BTB Transwell共培养模型，使用小鼠脑内皮细胞系bEnd.3或人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3分别与正常胶质细胞或GBM细胞共培养，模拟体内屏障；构建了稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶（GFP-Luc）的GBM细胞系及其NCL基因沉默（shRNA）细胞系，用于体内外功能研究；利用患者来源的GBM细胞建立了更贴近临床的原位移植瘤小鼠模型；通过蛋白质免疫印迹、流式细胞术、免疫荧光、免疫共沉淀、Pull-down实验、细胞功能实验（如CCK-8、EdU、TUNEL、Transwell迁移、成管实验、3D肿瘤球侵袭实验）等多种技术，在分子、细胞和动物水平系统评估了NCL转移、AS1411的BTB穿透及靶向能力，以及AS1411基PROTACs的蛋白降解效率和抗肿瘤效果。
研究结果
2.1 GBM来源的EVs将NCL转移至脑毛细血管内皮细胞，促进BTB形成
研究人员通过蛋白质组学分析发现，与正常星形胶质细胞来源的EVs相比，GBM细胞（U87MG）来源的EVs中NCL蛋白水平显著富集。在体外BBB/BTB共培养模型中，与GBM细胞共培养的内皮细胞表面检测到了NCL蛋白，而其mRNA水平并未升高，且该过程可被EVs分泌抑制剂GW4869所阻断，表明NCL是通过EVs从GBM细胞转移而来。这种EV介导的NCL转移显著增强了内皮细胞的增殖、迁移、成管能力并抑制其凋亡，即诱导了BBB向BTB的表型转化。在NCL沉默的GBM细胞或其来源的EVs处理组中，这些促BTB效应被显著削弱。在原位GBM小鼠模型中，肿瘤区域的毛细血管内皮细胞也高表达NCL，而接种NCL沉默的GBM细胞则减少了肿瘤内CD31+ 内皮细胞的密度和NCL表达。这些结果确立了EV介导的NCL转移是GBM诱导BTB形成的一个关键机制。
2.2 NCL诱导AS1411选择性跨BTB胞吞转运以靶向GBM细胞
NCL特异性DNA适配体AS1411能够高效结合并穿透由GBM细胞或GBM-EVs诱导形成的体外BTB模型，但不能穿透正常的BBB模型。这种穿透能力依赖于GBM来源的NCL，并可被网格蛋白介导的内吞作用抑制剂氯丙嗪、巨胞饮抑制剂阿米洛利以及胞吐作用抑制剂Endosidin-2所抑制，证明其通过受体介导的胞吞转运（RMT）机制。在体内，Cy5标记的AS1411能特异性积累在携带GBM的小鼠脑肿瘤区域，并与肿瘤细胞共定位，而对照序列或正常小鼠脑中则无此现象。该过程同样依赖于GBM表达的NCL。
2.3 AS1411表现出对GBM细胞的选择性内化
体外实验表明，AS1411能特异性结合并内化到表达表面NCL的GBM细胞（U87MG, U251）中，但不能进入表面不表达NCL的正常星形胶质细胞或非肿瘤源性上皮细胞。在3D肿瘤球模型中，AS1411也能有效穿透，且此穿透依赖于肿瘤球中NCL的表达。
2.4 AS1411基PROTACs促进NCL-MDM2复合物与靶蛋白的空间邻近
研究证实，在GBM细胞内，NCL与E3泛素连接酶MDM2存在相互作用，而AS1411可通过NCL“桥梁”募集MDM2。研究人员将AS1411分别与VEGFR2抑制剂Cediranib或EGFR抑制剂Gefitinib通过化学 linker 连接，构建了异双功能分子AS1411-Ced和AS1411-Gef。实验证明，这两种PROTACs能成功地将NCL-MDM2复合物拉近至其各自的靶蛋白（VEGFR2或EGFR）附近，形成MDM2-NCL-PROTAC-POI四元复合物。
2.5 AS1411基PROTACs以NCL和MDM2依赖的方式诱导靶蛋白降解
AS1411-Ced和AS1411-Gef能以浓度和时间依赖的方式，分别在GBM细胞中诱导VEGFR2和EGFR蛋白的泛素化及随后的蛋白酶体降解。这种降解作用严格依赖于NCL和MDM2的存在，单纯的AS1411、小分子抑制剂或其物理混合物均无此效果。蛋白质组学分析进一步证实，PROTACs处理可广泛影响VEGFR2或EGFR下游信号通路。
2.6 AS1411基PROTACs在体外表现出抗GBM效应
功能实验显示，AS1411-Ced和AS1411-Gef能显著抑制GBM细胞的增殖，促进其凋亡，并减弱3D肿瘤球的侵袭能力，效果远优于其单个组分或物理混合物。
2.7 AS1411基PROTACs在原位GBM异种移植瘤中表现出强大的抗肿瘤效力
在携带U87MG或患者来源GBM细胞的原位小鼠模型中，静脉注射AS1411-Ced或AS1411-Gef能有效抑制颅内肿瘤生长，显著延长小鼠生存期。肿瘤组织分析显示，治疗组中靶蛋白（VEGFR2/EGFR）水平降低，增殖标志物Ki-67减少，而细胞凋亡增加。重要的是，这些PROTACs未引起明显的全身毒性。
研究结论与讨论
本研究首次系统阐明了GBM来源EVs通过转移NCL至脑毛细血管内皮细胞表面，在驱动BBB向BTB病理转化中的核心作用。这不仅揭示了BTB形成的一个新机制，也解决了关于BTB与BBB差异的长期争议。更重要的是，研究团队发现，被转移至BTB内皮细胞表面的NCL，可作为RMT受体，介导其配体AS1411高效、选择性地穿越BTB。
基于AS1411兼具的三大功能——研究人员创造性地将AS1411开发为PROTACs的“弹头”和E3连接酶募集器。由此构建的AS1411基PROTACs（如AS1411-Ced, AS1411-Gef）成功地将“BTB穿透”、“GBM靶向”和“靶蛋白降解”三重能力整合于一体分子。
本研究以VEGFR2和EGFR为概念验证靶点，证明该策略能实现BTB穿透和肿瘤内靶蛋白的特异性降解，产生强效抗肿瘤活性且安全性良好。这为开发治疗GBM乃至其他脑部恶性肿瘤的靶向疗法开辟了一条极具前景的新途径。该策略的普适性意味着，未来可将AS1411与其他靶向配体结合，用于递送 siRNA、抗体、小分子药物等多种治疗剂穿越BTB，从而有望从根本上解决脑部肿瘤药物递送的瓶颈问题。
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