1 引言
脂肪因子在动脉粥样硬化的发展中扮演重要角色。在代谢紊乱时，内脏脂肪组织会分泌促炎脂肪因子，通过“由内而外”或从发炎的血管周围脂肪组织（PVAT）施加“由外而内”的机制影响血管壁。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白（CTRPs）家族属于脂肪因子家族。既往研究表明，CTRP家族成员参与调节动脉粥样硬化的不同病理生理阶段。CTRP3、CTRP9、CTRP12、CTRP13和CTRP15发挥抗动脉粥样硬化保护作用，而CTRP1、CTRP5和CTRP7则具有促动脉粥样硬化效应。近年来，关于CTRP4与心血管疾病关系的信息陆续报道。一项横断面研究显示，在2型糖尿病患者中，血清CTRP4浓度与颈动脉粥样硬化斑块呈负相关。此外，CTRP4可通过SIRT6/Nrf2通路限制内皮-单核细胞相互作用来减轻炎症。本研究旨在评估CTRP4在冠心病（CAD）中的作用及其机制。
2 方法
研究获得了上海交通大学机构审查委员会的伦理批准。从2023年1月至9月，连续纳入了556名接受经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的症状性CAD患者，经过排除标准后，最终323名CAD患者被纳入用于血清CTRP4测量，同时纳入了315名无心血管疾病的健康对照。此外，研究还获取了CAD患者（接受冠状动脉旁路移植术，CABG）严重动脉粥样硬化冠状动脉周围的心外膜脂肪组织，以及非CAD患者（接受其他心脏手术）非动脉粥样硬化冠状动脉周围的心外膜脂肪组织样本。
动物研究方面，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了CTRP4敲除（CTRP4−/−）小鼠，并与ApoE−/−小鼠杂交获得CTRP4−/−/ApoE−/−双敲小鼠。通过尾静脉注射重组CTRP4蛋白、脂肪组织移植、以及腺相关病毒（AAV）介导的基因过表达等多种方式，在动物模型中研究CTRP4的补充效应。
细胞实验主要使用了从小鼠骨髓提取并诱导分化的巨噬细胞（BMDMs）、人单核细胞白血病THP-1细胞以及3T3-L1前脂肪细胞系。通过蛋白质印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-IP）、表面等离子体共振（SPR）、质谱分析和分子对接等技术，探究CTRP4的相互作用蛋白及其分子机制。
3 结果
3.1 CAD患者血清和心外膜脂肪组织中CTRP4水平降低
与无CAD的对照组相比，CAD患者的血清CTRP4水平显著降低。CTRP4水平与反映冠状动脉病变严重程度的Gensini评分和SYNTAX评分均呈负相关。多变量逻辑回归分析显示，较低的血清CTRP4水平是CAD存在的独立风险因素。受试者工作特征曲线（ROC）分析表明，CTRP4对预测CAD具有一定价值。
在C57BL/6小鼠中，CTRP4蛋白在正常饮食小鼠的肠系膜脂肪组织（MAT）中富集，但在西方饮食（高脂饮食）喂养后，MAT中的CTRP4水平显著下降。
对来自CAD患者和非CAD患者的心外膜脂肪组织进行的RNA测序（RNA-seq）分析显示，与围绕非动脉粥样硬化冠状动脉的脂肪组织相比，围绕动脉粥样硬化冠状动脉的脂肪组织中CTRP4 mRNA表达显著下调。蛋白质印迹和免疫组织化学染色结果进一步证实了CTRP4蛋白在CAD患者心外膜脂肪组织中的表达降低。
对公开的人PVAT单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据集的分析表明，CTRP4转录本在脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等多种细胞群中均有表达。体外实验发现，用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、脂多糖（LPS）、白细胞介素-6（IL-6）或肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促动脉粥样硬化刺激物处理3T3-L1脂肪细胞或BMDMs，可在不同程度上降低CTRP4的表达。
3.2 CTRP4敲除促进ApoE−/−小鼠动脉粥样硬化发展；补充CTRP4可减轻动脉粥样硬化
与ApoE−/−对照小鼠相比，CTRP4−/−/ApoE−/−小鼠在西方饮食喂养12周后，主动脉和主动脉根部的动脉粥样硬化病变显著加剧，斑块内坏死核心直径增大，巨噬细胞浸润增加。
为了确定PVAT分泌的CTRP4是否通过旁分泌途径影响动脉粥样硬化，研究将野生型或CTRP4−/−小鼠的MAT移植到CTRP4−/−/ApoE−/−受体小鼠的颈动脉周围。结果显示，移植野生型脂肪组织可显著减轻受体小鼠颈动脉部分结扎诱导的斑块负荷，而移植CTRP4缺陷脂肪组织则无此效应。组织学分析表明，移植野生型脂肪组织的小鼠颈动脉斑块面积更小、胶原含量更高、坏死核心更小、巨噬细胞浸润更少。
此外，通过尾静脉给CTRP4−/−/ApoE−/−或ApoE−/−小鼠注射重组CTRP4蛋白，同样可以显著减轻主动脉和主动脉根部的动脉粥样硬化病变，表现为斑块面积减小、胶原含量增加、坏死核心缩小以及巨噬细胞浸润减少。这些结果说明，无论是通过PVAT旁分泌途径补充CTRP4，还是通过循环系统“由内而外”地补充CTRP4，都能有效抑制动脉粥样硬化的发展。
3.3 CTRP4在体外抑制LPS触发的巨噬细胞炎症因子诱导
对CTRP4−/−和野生型小鼠MAT的RNA-seq分析发现，CTRP4敲除后，脂肪组织中炎症相关基因显著上调，而脂质代谢促进基因下调。在巨噬细胞中，CTRP4蛋白能够减弱LPS诱导的细胞外信号调节激酶（ERK）、p38、c-Jun N端激酶（JNK）和核因子κB（NF-κB）通路的磷酸化激活。与野生型小鼠的BMDMs相比，CTRP4−/−小鼠的BMDMs在LPS刺激后，产生更多的炎症因子，如IL-1β、TNF-α和IL-6。而用重组CTRP4蛋白预处理，可以逆转CTRP4−/−BMDMs中LPS诱导的炎症因子高表达，且呈浓度依赖性。这些数据表明CTRP4在巨噬细胞中具有抗炎作用。
3.4 CTRP4通过与RAGE和TLR4结合发挥作用
为了解析与CTRP4相互作用的蛋白质，研究利用免疫沉淀和质谱分析发现CTRP4可下拉307种膜蛋白。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，这些蛋白显著富集于蛋白质糖基化、受体代谢过程、NF-κB活性调节、糖尿病、细胞粘附分子和脂质-动脉粥样硬化等通路。通过交叉对比分析，将晚期糖基化终末产物受体（RAGE）和Toll样受体4（TLR4）确定为CTRP4的潜在靶蛋白。
免疫共沉淀实验证实CTRP4能与RAGE和TLR4结合。表面等离子体共振分析进一步验证了CTRP4以剂量依赖的方式与RAGE和TLR4相互作用。分子对接分析预测CTRP4与这两个受体之间有很强的结合亲和力，并通过多个氢键形成复合物。
为了确定CTRP4与受体结合的关键区域，研究构建了CTRP4的截短突变体（CTRP4D1和CTRP4D2）以及一个结合缺陷的点突变体（CTRP4Mut，R69A/R71A/R98A/Y128A）。实验发现，CTRP4通过其第一个C1q球状头部结构域（D1结构域）与RAGE和TLR4结合，而CTRP4D2和CTRP4Mut与受体的结合能力大大减弱。
在功能上，野生型CTRP4能够抑制LPS、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）或S100钙结合蛋白A12（S100A12）等RAGE/TLR4配体诱导的ERK、JNK、p38和NF-κB通路激活，并减少IL-1β和TNF-α等炎症因子的产生。然而，CTRP4D2或CTRP4Mut处理则不能抑制这些通路或炎症因子的产生。
3.5 无法结合RAGE和TLR4的CTRP4突变体在体内抗动脉粥样硬化效应减弱
为了验证CTRP4的抗动脉粥样硬化作用是否依赖于其与RAGE/TLR4的相互作用，研究进行了体内实验。将感染了过表达野生型CTRP4、CTRP4Mut或对照病毒（AAV-Vector）的CTRP4−/−小鼠的MAT，移植到CTRP4−/−/ApoE−/−小鼠的颈动脉。结果显示，移植过表达野生型CTRP4脂肪组织的小鼠，其颈动脉斑块病变面积减小、胶原含量增加、巨噬细胞浸润减少；而移植过表达CTRP4Mut脂肪组织的小鼠则与对照组无显著差异。
同样，通过尾静脉给CTRP4−/−/ApoE−/−小鼠注射重组CTRP4Mut蛋白，也未能像野生型CTRP4那样减少斑块负荷、增加胶原含量或缩小坏死核心，斑块内仍有较大的坏死核心和较多的巨噬细胞浸润。
这些结果综合表明，CTRP4通过结合并抑制RAGE和TLR4来发挥其抗动脉粥样硬化效应，而丧失受体结合能力的CTRP4突变体则无法发挥相同的保护作用。
4 讨论
本研究证实，CTRP4在CAD患者的血清和心外膜脂肪组织中水平降低。CTRP4敲除会促进ApoE−/−小鼠的动脉粥样硬化。通过脂肪组织移植或静脉注射补充CTRP4，可以减轻CTRP4−/−/ApoE−/−小鼠的动脉粥样硬化。在细胞水平，CTRP4能抑制巨噬细胞中LPS诱导的炎症因子表达。机制上，CTRP4通过与RAGE和TLR4结合并抑制其活化来发挥作用。这些结果表明CTRP4是一种具有抗炎和抗动脉粥样硬化作用的保护性脂肪因子。
研究还对比了CTRP4与其他CTRP家族成员（如CTRP1和CTRP3）的受体结合特性。发现CTRP1和CTRP3也能与RAGE结合，但与TLR4的结合较弱。结构比较揭示，CTRP4独特的双C1q球状头部结构域可能决定了其区别于其他家族成员的受体结合谱。C1q头部结构域是整个CTRP家族中介导受体结合的关键结构模块。
本研究存在一定的局限性，例如属于横断面研究，仅能揭示CTRP4与CAD的关联性；CTRP4家族成员在炎症平衡中的具体作用及其与RAGE/TLR4的关系有待进一步阐明；CTRP4在动脉粥样硬化中细胞类型特异性的贡献也值得未来深入研究。
5 结论
综上所述，本研究证明脂肪因子CTRP4的抗炎和抗动脉粥样硬化作用是通过结合并抑制RAGE和TLR4信号通路来介导的。CTRP4水平的降低与CAD相关，而补充CTRP4可能成为对抗动脉粥样硬化的一种潜在治疗策略。
