KRASi锚定的CRISPR-Cas9 LOF筛选鉴定KRASi活性的调节因子
研究团队在携带KRASG12D、KRASG12C、KRASG12R和KRASQ61H突变的PDAC细胞系中，利用六种不同的KRAS抑制剂进行了12次基于CRISPR-Cas9功能缺失(LOF)的筛选。筛选结果显示，一些基因的缺失会增加细胞对KRASi的敏感性(负Δβ分数)，而另一些则驱动耐药性(正Δβ分数)。KEGG通路分析发现，ERBB、PI3K/Akt和MAPK信号通路在KRASi致敏基因中高度富集。筛选结束时，存活的耐药细胞表现出EGFR、ERK和Akt活性升高，以及MYC表达增加，这表明EGFR–RAS–ERK MAPK/PI3K–MYC轴在驱动PDAC对KRASi的耐药性中至关重要。验证研究发现，EGFR抑制剂厄洛替尼与突变选择性KRASi(如MRTX1133、adagrasib)以及RAS(ON)多选择性抑制剂RMC-7977的联合使用，均在测试的细胞系中表现出协同生长抑制效应。同样，YAP/TAZ-TEAD抑制剂IAG933与RMC-7977在九种KRAS突变PDAC细胞系中也显示出协同作用。
厄洛替尼与RMC-7977在部分PDAC细胞系中产生协同作用
尽管RMC-7977同时抑制突变型和野生型(WT)RAS蛋白，但令人意外的是，在部分PDAC细胞系中，其与厄洛替尼联用仍能产生协同增殖抑制效应，特别是在两个KRASQ61H突变细胞系和三个KRASG12X突变细胞系中。对于未显示协同效应的细胞系，使用泛ERBB抑制剂阿法替尼替代厄洛替尼后，部分细胞系也显示出协同效应。研究还发现，对联合治疗有协同反应的KRASG12X突变细胞系，其EGFR的表达水平和基础活性均更高，联合治疗能更有效地降低ERK活性。在患者来源的PDM-36类器官模型中也观察到了RMC-7977与厄洛替尼的协同作用。
KRASQ61H突变PDAC细胞系在药理学和遗传学上对KRAS的生存依赖性较低
研究发现，KRASQ61H突变细胞系对RMC-7977、BI-2865和AMG 410等多种KRAS抑制剂的敏感性均低于KRASG12D突变细胞系，且遗传学数据也显示其对KRAS的生存依赖性较低。这表明其敏感性降低主要源于KRASQ61H突变本身的生物学特性，而非特定KRASi的问题。临床数据分析也表明，KRASQ61H突变患者的预后更差。
野生型RAS在KRASQ61H突变PDAC细胞系中通过SOS1依赖性方式在KRASi处理后重新激活ERK
机制研究发现，在KRASQ61H突变细胞中，RMC-7977处理能迅速(2小时内)几乎完全抑制ERK活性，但随后ERK活性快速反弹，其反弹速度比在KRASG12D突变细胞中更快。急性RMC-7977处理后，KRASQ61H突变细胞中的HRAS和NRAS活性增加，而KRASG12D突变细胞中则未观察到。敲低SOS1可以消除这种补偿性的WT RAS GTP加载。遗传学抑制SOS1、HRAS、NRAS或其组合，能减少KRASQ61H突变细胞的生长，并使其对RMC-7977更敏感，而在KRASG12D突变细胞中则无此效果。这表明，由于KRASQ61H与SOS1的相互作用存在缺陷，且其作为NF1抑制剂紧密结合GAP蛋白，导致KRASQ61H突变细胞更依赖于SOS1和WT HRAS/NRAS。当KRAS被抑制时，SOS1能迅速激活WT RAS，导致ERK快速反弹。厄洛替尼与RMC-7977联用能减轻这种ERK反弹，这可能是其协同效应的机制。
验证CK2作为新型KRASi锚定CRISPR-Cas9 LOF筛选命中靶点
筛选数据显示，编码CK2α'和CK2β的基因CSNK2A2和CSNK2B的缺失是KRASi的致敏因素。药理学验证表明，选择性CK2抑制剂SGC-CK2-1和临床候选药物silmitasertib(CX-4945)均能单独引起增殖缺陷，并与MRTX1133或RMC-7977协同抑制KRAS突变PDAC细胞的生长。尽管CK2被报道可通过磷酸化MYC的S347/S348位点来稳定MYC蛋白，但在PDAC细胞中，CK2抑制并未缩短MYC的半衰期，表明协同效应可能不依赖于MYC的稳定性。进一步研究发现，敲低另一个CK2底物LEF1(在筛选中同样是致敏基因)，可以减弱RMC-7977与SGC-CK2-1的协同生长抑制效应，提示LEF1可能介导了部分协同作用。此外，CK2i增强了RMC-7977诱导的自噬流，表明自噬抑制不是其协同机制。
验证PI3K亚型作为新型KRASi锚定CRISPR-Cas9 LOF筛选命中靶点
编码p110γ的PIK3CG基因的缺失在筛选中被鉴定为致敏因素。研究证实，RMC-7977急性处理会降低多个PDAC细胞系中Akt的活性(多数在72小时内反弹)。过表达致癌型PIK3CG(L1018V)和PIK3CA(H1047R)能诱导对RMC-7977的耐药。选择性p110γ抑制剂eganelisib(IPI-549)和选择性PI3Kα抑制剂alpelisib，在浓度超过其亚型选择性阈值后，均能与RMC-7977在PDAC细胞系中产生协同生长抑制。这表明，在KRASi存在下，可能需要同时抑制多个PI3K亚型才能产生显著的生长缺陷，这可能与共同靶向Akt信号通路有关。
RMC-7977耐药的PDAC细胞发生上皮-间质转化(EMT)并部分依赖于ERK MAPK信号
为了研究对RMC-7977 + 厄洛替尼无内在协同反应的细胞是否会在获得性耐药后变得依赖EGFR，研究团队培育了对RMC-7977耐药的PDAC细胞系(Pa14C-R, Pa16C-R, PANC-1-R)。这些耐药细胞对RMC-7977的敏感性降低了超过1000倍。与亲本细胞相比，耐药细胞在RMC-7977长期处理下，其EGFR、ERK和Akt活性以及MYC蛋白水平逐渐上调并维持在较高水平。同样，对MRTX1133耐药的细胞也显示出ERK活性和MYC表达的上调。然而，这些对RMC-7977耐药的细胞并未对厄洛替尼变得更敏感，有些甚至表现出更强的耐药性。活性RAS下拉实验显示，耐药细胞中HRAS-GTP和NRAS-GTP的水平持续升高。显微镜观察和蛋白质印迹分析表明，耐药细胞发生了明显的形态学变化，呈现出间质样、纺锤形表型，并伴随着上皮标志物(如E-cadherin)的下调和间质标志物(如Vimentin、ZEB1、Fibronectin)的上调，这表明它们经历了上皮-间质转化(EMT)。尽管ERK活性在耐药细胞中有所下降，但它们仍然依赖于ERK MAPK信号通路，因为ERK抑制剂依然能有效抑制其生长。
讨论与总结
本研究通过全面的CRISPR-Cas9筛选，系统揭示了PDAC对KRAS抑制剂的耐药机制，并验证了多个有潜力的联合治疗靶点。研究发现，EGFR抑制剂与RMC-7977的协同效应在KRASQ61H突变细胞和EGFR高活性的KRASG12X突变细胞中尤为显著，其机制涉及抑制SOS1介导的WT RAS再激活和ERK反弹。同时，CK2抑制剂和PI3Kα/γ抑制剂也被证明能与KRASi产生协同效应。研究还指出，KRASQ61H突变因其独特的生化特性(如与SOS1相互作用缺陷、抑制NF1)，导致对KRAS抑制剂的敏感性降低，并更依赖于SOS1和WT RAS。此外，获得性耐药的细胞普遍发生了EMT转化，尽管ERK活性水平改变，但仍持续依赖ERK/MAPK通路。这些发现加深了对KRASi内在和获得性耐药的理解，并为设计针对不同KRAS突变亚型和耐药机制的联合疗法提供了重要的临床前依据，有望改善胰腺癌患者的治疗前景。
