一个用于剖析胰腺导管细胞早期肿瘤状态的人类模型
为了绘制胰腺细胞最早期的肿瘤性事件，研究人员利用可诱导表达致癌KRASG12D 的人类胚胎干细胞(hESC)来源的胰腺导管类器官(PDLO)，生成了具有时间分辨率的单细胞RNA测序( scRNA-seq )数据。通过强力霉素(Dox)诱导后，在多个时间点进行采样测序。数据分析显示，几乎所有的细胞都保留了导管特性，表明测序的PDLO培养物纯度很高。RNA速率分析揭示了细胞轨迹与Dox处理时间的一致性，KRASG12D 表达稳定且不显著影响内源性野生型KRAS的表达水平。免疫印迹实验证实了KRASG12D 诱导后MAPK信号通路(pERK/ERK)的激活增强。
重要的是，KRASG12D 的表达与关键的致癌程序，如MAPK和PI3K-AKT-mTOR信号、TNFα和NF-κB信号、上皮-间质转化(EMT)、增殖和衰老在早期时间点就呈现相关性。KRASG12D -PDLOs还表现出早期瘤变特征性基因的进行性表达。此外，ATAC-seq分析显示，在KRASG12D 诱导后，开放染色质区域的基因富集于细胞外基质(ECM)重塑、细胞运动和炎症相关的功能，这表明在癌变早期就快速启动了与生态位准备相关的程序。
基于KRASG12D 表达水平对单细胞进行分群揭示了生态位准备相关的特征
由于多克隆hESC KRASG12D 细胞系存在转座子插入的随机性，导致了细胞间KRAS表达水平的异质性。研究者根据细胞中KRASG12D 的表达水平，通过K-means聚类将它们分为低( KRASlow )、中( KRASintermediate )、高( KRAShigh )三个簇。将这些数据与已发表的PDAC单细胞数据集整合后发现，PDLOs在转录水平上连接了健康导管状态和恶性导管状态，验证了该模型用于研究PDAC发病机制的价值。
KRAShigh 和KRASintermediate 细胞簇相比KRASlow 细胞，其差异表达基因(GO)分析显著富集于ECM重塑和炎症相关的功能通路。这提示即使在缺乏特定生态位细胞的情况下，KRASG12D 也会在上皮细胞转化早期启动一个构建生态位的程序。研究团队进一步利用深度学习方法，基于单细胞转录组数据构建了高精度的KRAS依赖性细胞身份分类器。这些分类器不仅能区分模型中的细胞状态，还能准确区分临床PDAC样本与健康组织，并预测PDAC肿瘤微环境( TME )中基质细胞和免疫细胞组成的变化，突显了致癌KRAS驱动的分子程序塑造TME的潜力。
KRASG12D 表达诱导T细胞屏蔽并激活胰腺星状细胞(PaSCs)
对临床胰腺上皮内瘤变( PanIN )样本的免疫荧光分析发现，在癌前病变中已存在癌症相关成纤维细胞(CAF)和多种免疫细胞浸润的增加，这支持了早期生态位重塑的假说。为了在体外验证上皮KRASG12D 驱动的旁分泌信号对生态位主要成分的影响，研究建立了多种共培养体系。通过InterOMaX平台和微流控肿瘤芯片模型，发现表达KRASG12D 的PDLOs能够显著减少T细胞的浸润。这种T细胞屏蔽效应是由KRASG12D 诱导的上皮分泌组介导的，因为KRASG12D -PDLO的条件培养基也减少了T细胞的趋化迁移。T细胞表型分析显示，条件培养基并未改变T细胞亚群比例或活力/激活/耗竭状态。
另一方面，在与胰腺星状细胞(PaSCs)的直接共培养中，表达KRASG12D 的PDLOs能在短时间内显著促进PaSCs的生长。在间接共培养或使用条件培养基时，PaSCs的CAF标志物(如αSMA和IL6 )表达增加，表明其被激活并向CAF样表型转化。这些结果在多种共培养格式中均能重复，证实了KRASG12D 上皮分泌组可以激活PaSCs并限制T细胞接近。
TNFα减少T细胞迁移并激活促肿瘤的成纤维细胞
为了从计算层面探究早期的生态位准备，研究人员将自己的数据集与包含健康组织和散发性PanIN样本的单细胞图谱整合，进行了细胞通讯(CellChat)分析。结果显示，KRAS表达水平(低→中/高)的增加，特别是与病灶相关的生态位细胞之间的互作强度也随之增强。成纤维细胞在所有生态位细胞中展现出最强的信号输出能力。相互作用分析揭示了潜在的ECM信号通路(如COL1A1→整合素)和包括TNF在内的候选配体-受体对。TNF的流出信号随KRAS表达增强而升高，而病灶相关的生态位细胞(尤其是PaSCs)则是其高亲和受体TNFRSF1A (TNFR1)的主要接受者。
功能验证聚焦于分泌因子TNFα。ELISA检测证实，KRASG12D 的诱导显著且稳健地增加了PDLOs分泌TNFα。功能实验表明，向健康PDLO的条件培养基中添加TNFα会显著减少T细胞迁移，而使用英夫利西单抗( infliximab )中和KRASG12D -PDLO条件培养基中的TNFα，则足以逆转这种T细胞迁移抑制。这表明TNFα介导了T细胞屏蔽。此外，TNFα处理小鼠成纤维细胞改变了其亚群组成，诱导了一个表达ICAM1、VCAM1和CD105等粘附分子增多的亚群(Cluster 13)，这与肿瘤支持性成纤维细胞的表型特征一致。
与T细胞和胰腺星状细胞的PDLO共培养的单细胞RNA-seq分析
为了更全面地表征细胞间互作，研究者构建了包含PDLOs、T细胞和PaSCs共培养体系的第二个单细胞转录组数据集。分析显示，在T细胞共培养体系中，暴露于表达KRASG12D 的上皮细胞环境中的CD8+ T细胞表现出活化与迁移特征减弱，以及耗竭标志物表达增加的趋势，这些变化部分可被TNFα中和抗体所抵消。虽然T细胞亚群比例未发生显著改变，但转录组分析揭示了KRASG12D 诱导的核心增殖通路(mTORC1, Myc, E2F )、功能相关通路(IFNγ, IFNα )和应激相关通路(ROS, OXPHOS )的激活，其中多数富集通路与TNFα响应相关，提示TNFα是早期T细胞编程的关键驱动因子。
在PaSCs共培养体系中，单细胞分析发现了10个细胞亚群，但未能完全匹配已发表的成熟CAF程序，提示PaSC向CAF的重塑尚未完全完成。通过基因集模块评分分析发现，KRASG12D 诱导增加了iCAF、nCAF和pCAF状态的比例，同时减少了myCAF和apCAF状态。TNFα中和部分逆转了这种细胞状态分布的改变。差异表达基因分析显示，+Dox条件下PaSCs的炎症介质(如CSF2, CXCL8/3/2, IL6/1B/JUN )和细胞周期基因表达上调，而TNF阻断可减弱此效应。
细胞通讯分析显示，KRASG12D 的激活导致PDLOs、PaSCs和T细胞之间的相互作用信号显著增强。配体-受体通路分析突出了TNFα信号，以及其他潜在机制如免疫调节因子MIF、趋化因子CXCL、ECM/重塑因子COLLAGEN、FN1、TGFB等。值得注意的是，PaSCs是TNFα信号的主要接收者，而T细胞的接收信号较弱。最后，将“共培养模型”与来自健康/PanIN样本和PDAC组织的“原位生态位”预测的配体-受体对进行严格比较，发现只有TNF (和SEMA7A)在所有数据集中都出现交集，这支持了上皮KRAS通过TNFα来启动PaSCs向iCAF样炎症表型转化并调节早期T细胞程序的模型。
在不同模型中进行转化验证
研究首先分析了KRASG12D 小鼠模型胰腺组织的存档石蜡切片。RNAscope检测显示，随着PanIN病变从不典型增生低级别(LGD)向高级别(HGD)进展，上皮细胞内的TNFα转录本斑点显著增加。这一现象在含有人类PanIN的胰腺组织中也得到了证实。
更具临床转化意义的是，研究者前瞻性收集并分析了80名导管内乳头状粘液性肿瘤( IPMN )患者的囊液样本。囊液中TNFα的浓度随着疾病严重程度的升级呈现出阶梯式升高：低度不典型增生(LGD)患者囊液中TNFα水平最低，高度不典型增生(HGD)患者显著升高，而在IPMN衍生的浸润性癌( IC )患者中达到峰值。即使在将微浸润癌(T1a)与HGD合并分析时，TNFα水平也显著高于LGD组。由于囊液被上皮细胞分隔，这些数据有力地支持了转化中的上皮细胞是TNFα分泌的可能来源，并强调了上皮TNF程序在IPMN-PDAC连续进程中随侵袭性增强而加剧的临床相关性。
讨论与意义
这项研究表明，致癌信号KRASG12D 能在人类胰腺导管细胞系中迅速重编程上皮状态，并启动一个为肿瘤生态位做准备的通讯程序。通过使用干细胞来源的胰腺导管类器官模型并结合单细胞多组学技术，研究在癌前转化的起始阶段就捕捉到了上皮重塑的过程。研究发现，TNFα-NF-κB、IL-6/JAK-STAT3、TGF-β和ECM/整合素信号轴是早期生态位重塑的潜在驱动因素。
KRASG12D 诱导的上皮分泌组能激活PaSCs向促炎性的iCAF样状态转化，同时排斥T细胞浸润。TNFα在这一过程中扮演了核心角色，其中和抗体可以部分逆转这些KRASG12D 触发的改变。然而，KRASG12D 分泌组诱导M2型巨噬细胞趋化的效应似乎独立于TNFα，表明还存在其他平行或协同的信号通路。研究发现，TNFα的作用具有高度情境依赖性，其促肿瘤功能可能取决于其细胞来源、空间定位和局部受体激活情况。重要的是，TNFα的促肿瘤作用主要体现在调控生态位和免疫排斥，而非直接诱导上皮细胞死亡。
综上，研究揭示了一个KRAS→NF-κB→TNFα信号轴，它将上皮的致癌信号强度转化为基质激活和免疫重塑。这些发现强调了在胰腺癌发展的极早期阶段，致癌上皮细胞就已开始主动塑造其周围的微环境，为理解胰腺癌的起源和开发针对癌前病变的干预策略提供了新的视角和潜在靶点。
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