引言
在运动生理学研究领域，预绝经期女性的代表性历来不足，部分原因在于对月经周期波动和激素避孕使用可能影响研究结果的担忧。尽管有相关法规推动包容性，但在过去20年中，女性在运动研究中的参与比例仍保持稳定。近期研究开始关注月经周期阶段或激素避孕使用是否会显著影响运动表现、肌肉骨骼适应以及运动诱导的信号响应。运动的效应是多方面的，部分通过外泌因子的释放介导组织间通讯。其中，细胞外囊泡（EV）作为一种新兴的信号载体，在支持肌肉、脂肪和骨骼适应方面发挥着作用。EV携带的微小RNA对急性和慢性阻力运动均有响应，并受到年龄、生物性别和肥胖等因素的影响。然而，运动诱导的EV响应是否因月经周期阶段或激素避孕使用而在预绝经期女性中存在差异，此前从未被研究过。本研究旨在探究两个主要问题：第一，基线EV miRNA和代谢物含量是否受月经周期阶段或激素避孕使用的影响；第二，月经周期阶段或激素避孕使用是否影响急性阻力运动后的EV响应。此外，研究还测量了血浆中的游离代谢物，以比较其响应是否与EV代谢物不同，并观察组间差异。
材料与方法
本研究招募了年龄在18-40岁之间的健康女性参与者，她们被分为四组：自然月经周期的卵泡期组、黄体期组，以及使用激素避孕的女性组（包括口服避孕药组和激素宫内节育器组）。所有参与者进行了一次急性的、爆发性的下肢阻力运动（负重跳跃）。在运动前和运动后立即采集血样。通过尺寸排阻色谱法从血浆中分离EV，并通过纳米颗粒追踪分析、透射电子显微镜和免疫印迹（检测TSG101、CD9、CD81、CD63等标志物）进行表征。从EV中分离总RNA并进行小RNA测序，以分析miRNA表达。同时，对血浆和EV样本进行了非靶向代谢组学分析。采用DESeq2进行miRNA差异表达分析，使用MetaboAnalystR进行代谢物统计分析。此外，利用mixOmicsR包中的DIABLO框架进行了多组学整合分析，以探索不同组学数据集之间的关联，并寻找能够区分实验组的协调分子特征。
结果
参与者的基本特征和激素浓度如表1所示。四组在年龄、身高、体重或身体质量指数上均无差异。黄体期女性的孕酮浓度显著高于其他各组。EV表征数据显示，分离出的颗粒大小和丰度与小型EV和外泌体一致。各组间EV总蛋白浓度不受组别或急性运动的影响，但黄体期女性的EV RNA含量显著高于口服避孕药组和宫内节育器组。
小RNA测序与通路分析
对EV小RNA的分析显示，最丰富的20种miRNA平均占所有检测到miRNA的92%。在基线状态下，卵泡期女性与其他三组相比，其最丰富的20种miRNA中只有一种（miR-26a）是共有的，而黄体期、口服避孕药和宫内节育器三组之间有18种是共有的。基线差异表达比较表明，与黄体期相比，卵泡期有37种miRNA差异表达；与口服避孕药组相比，有43种；与宫内节育器组相比，有43种。其中一些与肌肉骨骼系统和运动适应相关的miRNA（如miR-1-3p和miR-27b-3p）在卵泡期女性的EV中含量较低。
急性运动后，四组中最丰富的20种EV miRNA中有17种是共有的。运动诱导了所有组的EV miRNA变化：卵泡期组有32种miRNA发生变化（占测量总数的7.6%），黄体期组有12种（2.5%），口服避孕药组有14种（4.7%），宫内节育器组有10种（2.3%）。其中，卵泡期女性在运动后变化最大，且在最丰富的miRNA（前25%）中变化比例最高。通路分析预测，运动后改变的miRNA可能对骨骼重塑、肌肉组织生长、结缔组织生长等生理功能以及mTOR、AKT、MAPKs、IGF-1等细胞内信号通路产生不同影响。
血浆与EV代谢物
非靶向代谢组学在EV样本中鉴定出1548种推定代谢物。运动显著改变了卵泡期组10种EV代谢物、黄体期组51种、口服避孕药组11种、宫内节育器组4种。代谢物变化仅在黄体期被预测会改变代谢通路。有趣的是，各组的EV中最富集的代谢物表现出高度一致性，无论组别或运动状态，前20种富集的代谢物中有18-19种是共享的。这些代谢物包括有机酸（如乳酸、草酸）、无机磷酸盐、甘油、肌酐代谢物和Omega-3脂肪酸代谢物（18-HEPE）等。
在血浆中，靶向代谢组学分析显示，运动后多种氨基酸和代谢途径相关代谢物（如丙氨酸、亮氨酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸）均显著升高，且无组间交互作用。非靶向分析鉴定出3133种推定代谢物，运动显著改变了卵泡期组60种、黄体期组15种、口服避孕药组22种、宫内节育器组46种血浆代谢物。这些变化预测会影响大量KEGG代谢通路，尤其是氨基酸和碳水化合物相关通路，但各组间影响的通路数量差异不大。总体而言，血浆代谢物对运动的响应不受月经周期或激素避孕使用的显著影响，且EV与血浆中共享的已知代谢物很少，表明EV并非已知运动响应代谢物的主要载体。
多组学整合分析
为探究是否存在协调的分子特征来区分不同组别，研究对运动前后的数据进行了多组学整合分析。分析包含了五个组学数据块：EV miRNA、血浆正/负离子模式代谢物、EV正/负离子模式代谢物。结果显示，在运动前，各数据块的样本图中几乎没有显示出明显的按组别聚类的证据。运动后，除了miRNA和EV正离子代谢物数据块外，其他数据块的趋势保持一致，没有明显的组间分离。在miRNA数据块中，观察到一些基于激素浓度的聚类趋势：大多数具有高孕酮和雌二醇浓度（宫内节育器组和黄体期组）的样本与低浓度（卵泡期组和口服避孕药组）的样本有所分离，暗示激素浓度可能影响运动后的EV miRNA组成。然而，聚类图像图和Circos图分析显示，虽然存在一些基于激素水平的亚聚类，但整体上并未形成能够清晰界定各组表型差异的强大多组学特征。特征之间的相关性分析表明，各数据集选定的特征在静息和运动后都显示出强烈的正相关，这些特征构成了独立于组别的、跨组学数据集的协调特征。
讨论
本研究首次探讨了月经周期阶段或激素避孕使用是否影响预绝经期女性急性阻力运动后的EV和代谢物响应。尽管在所有组中都观察到了运动响应，但卵泡期女性在基线和运动后的EV miRNA谱显示出一些差异。具体而言，卵泡期女性在静息时具有独特的EV miRNA谱，且运动诱导的EV miRNA变化幅度最大。然而，运动后最丰富的循环EV miRNA在各组间趋于相似，血浆代谢物响应在各组间也无显著差异。多组学整合分析发现了一些可能受循环激素浓度影响的分子特征迹象，但这些趋势并不足以表明存在明确的表型差异。
研究结果需要结合现有文献进行解读。关于月经周期是否影响阻力运动适应，学术界存在分歧。一些研究表明在卵泡期进行训练能获得更大的肌肉力量和体积增长，而另一些研究或综述则认为影响不大或没有影响。在运动因子响应方面，除生长激素外，大多数研究显示阻力运动后合成代谢因子、免疫细胞、乳酸和多种细胞因子的释放不受月经周期或激素避孕状态的影响。本研究补充了这一知识体系，表明EV miRNA和循环代谢物对运动的响应在预绝经期女性中普遍存在，且基本不受这些因素的根本性影响。卵泡期女性观察到的独特性和更强响应，是否会对长期运动适应产生可感知的影响尚难确定，但整体证据指向影响是轻微的。
研究的局限性包括：采用组间而非组内设计（即同一女性在不同周期阶段测试）、依赖自我报告和激素浓度确认月经周期阶段、可能低估口服避孕药使用者的合成雌激素浓度、EV分离过程未使用无血小板血浆等。尽管如此，其优势在于详细记录了参与者的月经和避孕史，并通过严格实验确认了EV的特征。
结论
本研究是一项探索激素避孕使用或月经周期阶段是否影响静息和运动后循环EV特征的开创性工作。研究表明，急性阻力运动会在所有组别中改变EV miRNA和循环代谢物。静息时，卵泡期女性的高丰度EV miRNA谱与其他组不同，但在运动后趋于一致。卵泡期女性的EV miRNA对运动响应最大。在代谢物方面，血浆对运动的响应组间无差异，且EV似乎不是运动响应代谢物的主要载体。综合分析显示存在一些激素诱导的分子特征迹象，但不足以界定表型。总体证据表明，月经周期和激素水平（独立于激素避孕使用/月经周期阶段）对静息和运动后的循环EV内容有轻微影响，但这些变量似乎并不会从根本上改变循环EV和代谢物谱。未来研究应扩展人群范围，纳入本研究所用身体质量指数范围之外以及围绝经期和闭经女性。
