引言
化疗仍然是中晚期和转移复发性结直肠癌的主要治疗方法，但其疗效常因化疗耐药而受到限制。肿瘤微环境中的代谢调节因子在化疗耐药中起着关键作用。POU2F1（也称为OCT1）是一种已知的转录因子，我们前期的研究表明其可通过促进Warburg效应来调节耐药。有趣的是，在预实验中，我们发现敲除POU2F1可加速胞质乳酸的积累并诱导细胞内蛋白乳酸化。乳酸作为糖酵解的代谢产物，可通过建立免疫抑制性肿瘤微环境来促进肿瘤进展。近年来，赖氨酸残基的乳酸化修饰已被鉴定为一种能直接刺激染色质基因转录的表观遗传修饰，也有报道称蛋白乳酸化通过促进DNA末端切除和同源重组来驱动化疗耐药。尽管POU2F1与Warburg效应之间的调节可能诱导结直肠癌的化疗耐药，但POU2F1依赖性耐药的确切机制仍不清楚。
POU2F1以MDR2依赖性方式诱导化疗耐药
为阐明POU2F1的致癌作用，我们在POU2F1敲低的结直肠癌细胞中进行了定量蛋白质组学分析和转录组测序。生物信息学分析表明，差异表达的基因/蛋白质在药物反应通路中显著富集。对TCGA-COAD和GEO数据集的分析显示，POU2F1在化疗难治性结直肠癌队列中过表达，且其高表达与不良的无进展生存期和总生存期相关。免疫组化和免疫印迹分析证实，与化疗敏感的样本和细胞系模型相比，POU2F1在化疗耐药的结直肠癌标本和细胞系模型中表达上调。功能验证研究表明，POU2F1过表达以剂量和时间依赖性方式保护结直肠癌细胞免受奥沙利铂和伊立替康诱导的细胞毒性。相反，在POU2F1缺失的细胞中进行基因回补可恢复化疗耐药表型。这些数据共同确立了POU2F1是结直肠癌获得性化疗耐药的关键介质。
为了阐明POU2F1介导化疗耐药的机制基础，我们分析了POU2F1沉默的结直肠癌细胞的蛋白质组学数据，并鉴定出MDR2、MRP2和TOP2A等已知的耐药相关蛋白为差异表达蛋白。其中，MDR2在POU2F1调控下变化最为显著。免疫组化证实POU2F1与MDR2表达呈强正相关，且POU2F1过表达可在沉默细胞中恢复MDR2水平。与邻近组织相比，MDR2在肿瘤组织中表达更高，且在化疗耐药的结直肠癌中表达最为显著。生存分析显示，高MDR2表达与较差的PFS和OS相关。值得注意的是，MDR2的沉默或过表达不影响结直肠癌的生长，但其在TCGA队列和GSE69657数据库中化疗治疗患者中的水平更高。功能上，MDR2过表达减少了奥沙利铂和伊立替康诱导的细胞死亡。为确认MDR2在POU2F1介导的耐药中的作用，我们使用了shRNA和抑制剂Bromosulfalein来阻断MDR2，两种方法均逆转了POU2F1诱导的化疗耐药。这些发现表明，POU2F1通过上调MDR2驱动结直肠癌化疗耐药。
鉴定PPP1R11为MDR2泛素化的负调节因子
为了阐明POU2F1如何上调MDR2，我们首先观察到POU2F1增加了MDR2蛋白水平而不影响其mRNA表达。放线菌酮追踪实验显示，POU2F1缺失缩短了MDR2的半衰期，表明POU2F1通过抑制其降解来稳定MDR2。由于我们的蛋白质组学数据将POU2F1沉默与蛋白质泛素化途径联系起来，我们假设POU2F1通过泛素化调节MDR2稳定性。免疫共沉淀实验证实，POU2F1减少了MDR2的泛素化，支持了其在翻译后稳定中的作用。为了鉴定负责MDR2降解的泛素连接酶，我们筛选了蛋白质组学数据并鉴定出PPP1R11，这是一种在POU2F1缺失时上调的RING finger E3连接酶。有趣的是，基于TCGA数据库和免疫组化分析，PPP1R11在结直肠癌组织中表达下调，且高PPP1R11表达与更好的生存期相关，提示其可能起到肿瘤抑制因子的作用。进一步分析显示，基于免疫组化分析，POU2F1与PPP1R11在结直肠癌中呈负相关。POU2F1低/PPP1R11高的患者表现出最长的OS和PFS，而POU2F1高/PPP1R11低的病例预后最差。这些发现表明PPP1R11是POU2F1的下游效应因子，通过泛素化控制MDR2的稳定性。
鉴于先前有证据表明RING finger E3连接酶PPP1R11介导TLR2泛素化，我们研究了POU2F1是否通过PPP1R11调节MDR2稳定性。值得注意的是，免疫共沉淀证实了PPP1R11与MDR2之间存在物理相互作用，体外泛素化实验证明PPP1R11显著增强MDR2的多聚泛素化。接下来，结构域缺失突变体将关键的泛素化区域定位到MDR2的401–600氨基酸残基。系统的赖氨酸到精氨酸突变鉴定出K413和K538是PPP1R11介导的泛素化和降解的关键位点。突变任一残基都会废除MDR2的泛素化。此外，PPP1R11选择性催化MDR2的K48连接和K63连接的多聚泛素化，这通常分别靶向蛋白质进行蛋白酶体降解或改变其功能。
综上所述，PPP1R11通过促进MDR2在K413和K538位点的K48/K63连接泛素化，作为MDR2的直接负调节因子，从而标记其进行降解。
POU2F1通过抑制PPP1R11介导的MDR2泛素化赋予化疗耐药性
先前研究表明PPP1R11诱导结直肠癌细胞中MDR2泛素化，而POU2F1过表达抑制PPP1R11表达。为了研究POU2F1介导的PPP1R11下调是否有助于MDR2泛素化和化疗耐药，我们进行了一系列实验。体外分析显示，PPP1R11过表达抵消了POU2F1对MDR2在K413和K538位点泛素化的抑制作用，而PPP1R11沉默则增强了这种抑制。此外，PPP1R11过表达降低了POU2F1过表达的结直肠癌细胞的增殖，并恢复了POU2F1过表达的结直肠癌细胞对奥沙利铂和伊立替康的化疗敏感性。值得注意的是，我们进行了体内实验，Kaplan-Meier分析显示，接种HCT116-POU2F1细胞的小鼠总生存期显著缩短，但共表达PPP1R11延长了生存期。HCT116-POU2F1小鼠的肿瘤生长速率和重量增加，而PPP1R11过表达减弱了这些效应。此外，MDR2表达的免疫组化分析与这些观察结果一致。
这些结果共同表明，POU2F1通过减少PPP1R11介导的MDR2泛素化，从而促进结直肠癌的化疗耐药。
POU2F1对PPP1R11乳酸化的抑制减弱了其表达和酶活性
先前研究表明，POU2F1通过对抗PPP1R11表达来减轻MDR2的泛素依赖性降解。为了阐明POU2F1在结直肠癌中抑制PPP1R11表达的机制，我们聚焦于代谢重编程，这是蛋白质表达的已知调节因子。这种方法尤其相关，因为我们前期的发现表明POU2F1通过促进代谢重编程诱导奥沙利铂耐药。有趣的是，我们的调查显示POU2F1显著降低了胞质乳酸水平，并且胞质乳酸浓度与PPP1R11表达和MDR2泛素化呈正相关。我们进一步证明，增加乳酸可用性（通过补充20 mM乳酸、使用乳酸转运蛋白MCT1/MCT4双重抑制剂Syrosingopine处理，或使用鱼藤酮）可逆转POU2F1介导的PPP1R11抑制。相反，降低胞质乳酸（通过LDH抑制剂RS6212或LDHA siRNA）增强了POU2F1对PPP1R11表达的抑制作用。这些结果共同表明，POU2F1通过减少结直肠癌细胞中胞质乳酸的积累来下调PPP1R11表达。
在证明了POU2F1通过降低胞质乳酸水平来减少PPP1R11表达后，我们试图阐明低胞质乳酸与结直肠癌中PPP1R11下调相关的分子机制。近期研究强调乳酸化是一种关键的翻译后修饰，胞质乳酸通过此修饰调节蛋白质稳定性、酶活性和蛋白质-蛋白质相互作用。在本研究中，我们的调查结果显示，与对照组相比，POU2F1沉默细胞中的整体乳酸化水平显著升高。乳酸化组学和蛋白质组学的整合分析显示，在POU2F1沉默的SW620细胞中，PPP1R11表达和乳酸化增加，且离体验证据实了来自乳酸化组学数据的PPP1R11乳酸化。在PPP1R1中仅鉴定出一个保守的乳酸化位点（K59），该位点从斑马鱼到智人显示出显著的进化保守性。接下来，我们构建了PPP1R11 K59R突变体，并观察到K59R突变在乳酸或葡萄糖刺激下显著降低了乳酸化水平，表明乳酸化主要发生在PPP1R11的K59位点。
为了进一步阐明乳酸化如何介导POU2F1诱导的PPP1R11抑制，我们进行了一系列功能实验。首先，我们观察到POU2F1显著缩短了PPP1R11的半衰期，这种效应可被乳酸或高葡萄糖处理逆转，并且增强了PPP1R11的泛素化，后者可被POU2F1抑制、乳酸或高葡萄糖处理减弱。然后，免疫印迹显示，在乳酸处理下，POU2F1显著缩短了PPP1R11K59R突变体的半衰期，但对野生型PPP1R11无此影响，证明了乳酸化在蛋白质稳定性中的重要作用。此外，在乳酸或高葡萄糖处理后，PPP1R11K59R突变体表现出比野生型更强的泛素化，且POU2F1过表达进一步增强了这种效应。巧合的是，我们首次发现，在乳酸或高葡萄糖条件下，PPP1R11WT显示出比K59R突变体显著更高的E3连接酶活性，这与之前的报道一致。此外，在乳酸处理期间，POU2F1减弱了PPP1R11WT的E3连接酶活性，但对K59R突变体没有影响。综上所述，这些结果表明，POU2F1通过损害PPP1R11的乳酸化来促进其抑制，从而降低其蛋白质稳定性和E3连接酶活性。
POU2F1通过对抗其乳酸化来抑制PPP1R11介导的MDR2泛素化
鉴于PPP1R11在K59位点的乳酸化在调节其稳定性和E3连接酶活性中的关键作用，我们首先检查了乳酸和葡萄糖如何影响MDR2泛素化。高剂量乳酸或葡萄糖处理 robustly 增加了表达野生型PPP1R11的细胞中MDR2的泛素化，而K59R突变体仅部分重现了这种效应。与此一致，在低剂量乳酸或葡萄糖条件下，PPP1R11介导的MDR2泛素化明显更弱。在不同的PPP1R11K59R和PPP1R11WT结直肠癌细胞组中，观察到外源表达LDHA对MDR2泛素化的类似影响模式，表明PPP1R11乳酸化对其介导的MDR2泛素化至关重要。为了测试POU2F1是否通过调节PPP1R11乳酸化来限制MDR2泛素化，我们进行了体外泛素化实验，结果显示，尽管POU2F1有抑制作用，PPP1R11WT完全挽救了MDR2泛素化，而PPP1R11K59R即使存在乳酸也只部分恢复了泛素化，这意味着POU2F1通过特异性干扰PPP1R11乳酸化来抑制MDR2泛素化。我们接下来探究PPP1R11乳酸化是否有助于POU2F1驱动的结直肠癌恶性进展。确实，PPP1R11WT增强了生长抑制并使细胞对奥沙利铂和伊立替康敏感。相反，虽然PPP1R11WT完全抵消了POU2F1诱导的化疗耐药，但PPP1R11K59R仅有部分效果。这些数据共同支持了一个模型，即POU2F1通过阻断K59位点的乳酸化来抑制PPP1R11介导的MDR2泛素化。
POU2F1促进的MCT4介导的乳酸分泌有助于减少PPP1R11乳酸化
在证明了POU2F1通过降低胞质乳酸水平来减少PPP1R11乳酸化后，我们试图确定POU2F1如何实现这种效应。有趣的是，虽然POU2F1过表达增加了总乳酸产量，但矛盾地降低了细胞内乳酸含量，这提示乳酸外排增强。由于单羧酸转运蛋白在乳酸穿梭中起关键作用，我们重新审视了早期的转录组数据，结果显示在POU2F1沉默的结直肠癌细胞中，MCT4、MCT3和SMCT2一致下调。虽然大多数研究关注MCT1介导的乳酸输入，但我们的发现凸显了MCT4的独特作用——在所有MCT家族成员中，只有MCT4在POU2F1敲低时在mRNA和蛋白水平上均表现出显著降低，而这种效应可被POU2F1重新表达所逆转。因此，我们选择其进行进一步分析。临床上，高MCT4表达与结直肠癌患者较差的PFS和OS密切相关。值得注意的是，POU2F1高/MCT4高肿瘤患者预后最差，而POU2F1低/MCT4低的患者预后最好。实验上，MCT4缺失增加了胞质乳酸积累，而MCT4过表达可挽救此现象。为了测试MCT4在PPP1R11乳酸化中的作用，我们发现即使在高乳酸/葡萄糖条件下，MCT4抑制也能减少乳酸化。相反，MCT4过表达削弱了这些处理对乳酸化的增强作用。关键问题仍然是：MCT4是否介导了POU2F1的效应？确实，MCT4抑制剂MSC-4381在高葡萄糖处理期间提高了细胞内乳酸和PPP1R11乳酸化水平。此外，在这些条件下，MCT4沉默在很大程度上废除了POU2F1降低胞质乳酸和PPP1R11乳酸化的能力。总之，这些发现确立了MCT4驱动的乳酸外排是POU2F1抑制PPP1R11乳酸化的关键机制。
POU2F1在结直肠癌中转录激活MCT4表达
为了理解POU2F1如何上调MCT4以减少结直肠癌细胞内乳酸积累，我们首先证实POU2F1缺失显著降低了MCT4 mRNA水平。这促使我们研究POU2F1是否直接调节MCT4转录。使用荧光素酶报告基因检测，我们在MCT4转录起始位点上游2000bp区域内鉴定出强启动子活性。生物信息学分析揭示了MCT4启动子中存在11个潜在的POU2F1结合位点。在HEK293T、HCT116和SW620细胞中的染色质免疫沉淀-qPCR显示POU2F1特异性结合到位点6–8，而在IgG对照中未检测到信号。为了确定关键的结合位点，我们生成了MCT4启动子突变体，荧光素酶实验表明POU2F1过表达显著增强了野生型MCT4启动子活性。有趣的是，位点2和4的突变完全废除了这种激活，而位点1和3的突变具有部分效应。与这些发现一致，蛋白质印迹分析显示，只有MCT4-mut2和-mut4损害了POU2F1促进MCT4表达和乳酸外排的能力。正如预期的那样，PPP1R11乳酸化在这些突变体中表现出相反的模式。这些结果清楚地证明，POU2F1直接结合到MCT4启动子中的两个特定TAAT基序以驱动转录，从而增强乳酸外流，并最终减少PPP1R11乳酸化。
讨论
我们之前的工作表明，结直肠癌中POU2F1升高与不良预后相关，并促进奥沙利铂耐药，突出了其作为治疗靶点的潜力。化疗耐药通常涉及介导药物外排的ATP结合盒转运蛋白。虽然靶向ABC转运蛋白的疗法显示出临床前景，但优化其抑制剂需要对它们在肿瘤中的调节机制有更深入的了解。在这里，我们发现POU2F1缺陷通过增强MDR2泛素化和降解使结直肠癌细胞对奥沙利铂和伊立替康敏感，这与PPP1R11上调同时发生。MDR2是ABC转运蛋白的关键成员，是癌症中公认的多药耐药调节因子。值得注意的是，我们的发现与Awoniyi等人和Shriki等人的近期研究一致。从机制上讲，POU2F1抑制PPP1R11表达并抑制MDR2泛素化，这些效应在体外PPP1R11过表达时可逆转。这些结果确立了POU2F1是通过PPP1R11介导的泛素化调节MDR2稳定性的调节因子，提出POU2F1抑制作为克服结直肠癌化疗耐药的新策略。
肿瘤缺氧和癌基因驱动糖酵解代谢，导致过量乳酸产生和胞质酸化。单羧酸转运蛋白，特别是MCT1和MCT4，在乳酸稳态中发挥不同作用。虽然MCT1输入乳酸以促进肿瘤生长，但主要在缺氧条件下表达的MCT4——主要在细胞内水平升高时输出乳酸。值得注意的是，MCT抑制诱导的乳酸积累促进化疗耐药。我们的研究表明，POU2F1通过增强其启动子活性特异性上调MCT4。重要的是，MCT4抑制逆转了POU2F1介导的对乳酸积累和PPP1R11表达的影响。这些发现表明，细胞内乳酸滞留可以与POU2F1对糖酵解调节的影响产生协同作用。
乳酸是糖酵解的副产物，在肿瘤生物学中既作为代谢底物又作为信号分子。在肿瘤微环境中，乳酸促进免疫抑制和肿瘤进展。一个关键机制是乳酸化，这是一种乳酸修饰赖氨酸残基以调节细胞过程的表观遗传修饰。这种修饰通过乳酸辅酶A形成催化，通过调节信号通路和基因表达影响肿瘤细胞行为，包括耐药性。众所周知，乳酸化最初主要发现发生在组蛋白上，但近年来研究也扩展到非组蛋白，包括细胞质和细胞核中的蛋白质，包括膜蛋白。对于膜蛋白，其胞内结构域上的赖氨酸残基是乳酸化的主要位点。这些区域暴露在细胞质中，可以与乳酸产生的“供体”分子接触。膜蛋白，特别是其胞质部分，可以发生乳酸化修饰，这种修饰是代谢物直接快速调节膜蛋白功能的重要机制之一。一些研究提供了膜蛋白乳酸化的具体证据。例如，研究表明EGFR可以被乳酸修饰，进而影响其二聚化、自磷酸化以及下游信号通路如MAPK和PI3K/AKT的激活，最终影响肿瘤细胞增殖。然而，我们的研究表明，POU2F1降低了结直肠癌细胞中的整体蛋白乳酸化，特别是在PPP1R11K59位点，但不包括MDR2。这表明MDR2的表达或功能不受乳酸化的直接调节，但仍需进一步研究。
靶蛋白的乳酸化不仅可以直接调节其酶活性，还可以通过影响其结构构象来调节其蛋白质表达。例如，LDHA在K81/K318位点的乳酸化显著增强其酶活性而非表达，从而促进肺腺癌的卡铂耐药。类似地，在心肌缺血-再灌注损伤中，Serpina3k的K351乳酸化增强了蛋白质稳定性，导致蛋白质水平上调并产生后续的心脏保护作用。有趣的是，乳酸化减少会 destabilize PPP1R11蛋白并增强其E3连接酶活性，促进MDR2泛素化。然而，肿瘤微环境中的其他因子也可能通过复杂的网络调节PPP1R11，正如Dichtl等人的发现所暗示的那样，Kla可能是蛋白质表达的结果而非原因。然而，我们不能完全排除可能通过构成复杂的表达调节网络影响PPP1R11表达的其他因素。实际上，已知的PPP1R11调节因子Wnt、HIF-1α、PI3K/AKT和STAT3通路的激活被报道控制PPP1R11表达。此外，生物信息学分析显示PPP1R11启动子中存在潜在的POU2F1结合位点，表明POU2F1可能调节PPP1R11的转录表达。其他机制可能参与我们的模型，这或许可以解释POU2F1不能完全消除PPP1R11表达的结果。值得注意的是，我们观察到乳酸化与泛素化位点之间存在空间邻近性，表明蛋白质稳定性调节中可能存在交互作用。
虽然许多蛋白质含有乳酸化位点，但这种修饰的酶促调节仍不完全清楚。目前的证据表明，乙酰转移酶和去乙酰化酶可以分别催化乳酸化和去乳酸化。几种赖氨酸乙酰转移酶，包括TIP60和KAT2A/ACSS2，已被证明介导蛋白质乳酸化。例如，据报道TIP60介导的Vps34乳酸化参与促进其脂质激酶活性，以促进细胞自噬和内溶酶体降解。此外，一项新研究指出，KAT2A与ACSS2偶联，作为乳酸转移酶，诱导H3K14和H3K18的乳酸化。在此，发现POU2F1减少PPP1R11乳酸化，从而稳定该蛋白并维持其E3酶活性。然而，调节PPP1R11的特异性乳酸转移酶/去乳酸酶仍未被鉴定。有趣的是，我们的蛋白质组学分析显示KAT7在POU2F1沉默时上调。尽管KAT7作为乳酸转移酶的潜力需要验证，但这些发现表明KAT7可能在PPP1R11调节中发挥作用。需要进一步的研究来鉴定控制PPP1R11乳酸化的完整酶机制。
总之，我们的研究揭示了POU2F1是MDR2泛素化和降解的新调节因子，揭示了POU2F1-MCT4-PPP1R11乳酸化轴是控制MDR2稳态的关键机制。这些发现不仅为通过抑制POU2F1克服化疗耐药提供了新的治疗靶点，也为优化针对结直肠癌化疗耐药的靶向干预策略提供了重要见解。
