皮下血管化微环境（NICHE）中局部免疫调节与药物生物分布的系统性剖析
1 引言
系统性免疫抑制对于防止同种异体移植排斥反应至关重要，但其长期使用会带来显著的毒性，包括移植物毒性、机会性感染和相关恶性肿瘤风险。这影响了患者生活质量，限制了同种异体胰岛移植作为1型糖尿病（T1D）功能性治疗方法的更广泛应用。此外，免疫抑制剂（IS）的系统性给药往往无法在移植物部位达到有效浓度，同时使非靶器官暴露于高药物水平，加剧累积毒性。这些局限性凸显了对位点特异性免疫调节策略的需求，以在最小化全身暴露的同时保护胰岛活力。
尽管免疫抑制剂在器官移植中广泛应用，但对于胰岛移植的最佳免疫抑制方案尚无共识。局部免疫抑制策略，尤其是在可及的皮下移植平台中，提供了有前景的替代方案。然而，关于个体免疫抑制剂在局部递送时的表现及其全身作用机制在受限移植位点是否适用，目前尚不清楚。为填补这一知识空白，本研究利用了新血管化可植入细胞归巢与封装（NICHE）装置，作为一个空间明确且可重复的模型，来研究同种异体胰岛移植中的局部免疫调节。
研究选择了五种靶向移植排斥反应互补节点的临床相关免疫抑制剂：CTLA4-Ig（阿巴西普/贝拉西普）、抗淋巴细胞血清（ALS，胸腺球蛋白类似物）、抗CD40L、抗CD2和抗IL6。这些药物的选择基于其互补的作用机制，包括T细胞共刺激阻断（CTLA4-Ig，抗CD40L）、淋巴细胞耗竭（ALS，抗CD2）、细胞因子信号干扰（抗IL6）以及抗原呈递细胞（APC）活性调节（抗CD40L，抗CD2）。本研究旨在利用NICHE平台，系统性地剖析这些药物在局部递送时的安全性、局部与全身免疫调节效应、药代动力学和纵向生物分布，从而为同种异体细胞移植的理性、机制指导的组合方案设计提供依据。
2 结果
2.1 体外免疫抑制活性与胰岛相容性
研究首先通过大鼠同种异体细胞示踪紫（CTV）标记的混合淋巴细胞反应（MLRs）评估了免疫抑制剂对T细胞增殖的抑制影响，并同步通过灌注葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验和活/死染色评估了胰岛功能与活力，以确定安全有效的剂量范围。
−1); (C, G, K, O, S) insulin release curves from perifusion GSIS and (D, H, L, P, T) associated stimulation index with % viability of pancreatic islets incubated in the presence or absence of IS.">
CTLA4-Ig在所有测试浓度下均能抑制B细胞、自然杀伤（NK）细胞、CD4+ 和CD8+ T细胞等淋巴亚群的增殖，但调节性T细胞（Tregs）在所有浓度下均减少。胰岛功能在高达1 mg mL−1 浓度下未受影响。ALS介导的总反应淋巴细胞群耗竭导致T细胞增殖的表观增加，但增殖T细胞的绝对数量并未增加。在50 μg mL−1 浓度以下，胰岛GSIS功能得以保持，但在100 μg mL−1 时观察到活力下降。抗CD40L（MR-1克隆）可抑制T细胞增殖，并在较高浓度下增加Treg频率。胰岛功能在高达1 mg mL−1 浓度下未受影响。抗CD2可抑制NK细胞和T细胞的增殖，对Treg群体影响最小，且不影响胰岛功能。抗IL6表现出与抗CD2相当的抑制能力，可保留Tregs，且在高达1 mg mL−1 浓度下不损害GSIS或活力。这些体外实验确认了物种特异性交叉反应性，建立了安全的剂量范围，为后续体内研究提供了指导。
2.2 NICHE装置中的药物生物分布
NICHE平台是一个可植入的3D打印细胞封装装置，包含一个用于移植细胞的血管化细胞储库，其周围环绕着一个药物储库。药物储库装载免疫抑制剂溶液，通过浓度驱动的扩散穿过纳米多孔膜进入中央细胞室，提供持续局部免疫保护，同时限制全身暴露。
CTLA4-Ig表现出近似稳态的释放动力学，局部浓度最高，血浆浓度约为细胞储库的1/10，全身器官暴露有限。ALS的累积释放显示初始爆发后转为较慢的稳态动力学，局部微环境浓度相对稳定，血浆浓度约为细胞储库的1/5，全身暴露则低约50倍。抗CD40L在第三天后的释放较慢，早期在细胞储库中积累，血浆浓度约为局部的1/20，但会在肾脏中积累。抗CD2的累积释放呈现一级动力学，血浆和全身器官中的药物浓度分别比局部微环境低约10倍和250倍。抗IL6的释放动力学与ALS和抗CD40L相似，在细胞储库和纤维化包囊中的浓度相当且稳定，血浆浓度约为局部的1/4至1/10，全身器官浓度则低约150倍。总的来说，NICHE能够实现免疫抑制剂的持续原位释放，但不同药物的全身暴露程度因其药代动力学特征而异。
2.3 无免疫抑制时的免疫反应特征
为了表征同种异体胰岛移植在皮下部位的基线免疫反应，研究评估了在没有免疫抑制治疗情况下局部和全身免疫细胞在30天内的动态变化。
移植前，局部免疫浸润主要由CD11b+ 和CD11c+ 髓系细胞组成。移植后，B细胞和中性粒细胞频率显著增加，同时树突状细胞（DCs）有增加趋势，这与早期先天免疫反应一致。巨噬细胞和NK细胞的比例保持稳定。适应性免疫细胞在移植后时期逐渐积累，总T细胞、CD4+ 和CD8+ T细胞亚群在移植后第14天显著增加。效应记忆T细胞（Tem）在两个亚群中也遵循相似模式，在第14天增加并在第30天达到更高水平。相比之下，调节性T细胞（Tregs）在第14和30天显著下降。CD8+ T细胞中颗粒酶B+ 的比例在第30天显著增加，表明细胞毒性T细胞活化。M1样巨噬细胞保持稳定，而M2极化在第14天显著增加，随后下降。全身免疫分析显示，全血和脾脏中的CD3+ T细胞频率最初下降，但在第30天恢复，而引流淋巴结（dLN）在第7天出现短暂增加。这些发现揭示了一个时间协调的免疫反应，其特征是初始髓系细胞流入，随后是持续的效应T细胞活化和调节表型的减少。
2.4 CTLA4-Ig的局部递送抑制效应免疫反应但耗竭Tregs
CTLA4-Ig治疗组的tSNE图显示，与第3天相比，移植后时期（特别是第30天的淋巴群体）没有明显的免疫细胞浸润增加。CTLA4-Ig是唯一一个在第30天显示浸润免疫细胞绝对数量显著减少的治疗组。定量热图分析显示，早期（第7天）B细胞和包括中性粒细胞、树突状细胞和NK细胞在内的先天免疫亚群减少。CTLA4-Ig还减少了CD4+ 和CD8+ T细胞及其效应记忆和中央记忆亚群在移植后较晚时间点的局部浸润。细胞毒性活化也受到抑制，表现为颗粒酶B+ CD8+ T细胞减少。重要的是，CTLA4-Ig治疗导致Tregs显著减少，这是该疗法的一个已知局限性。此外，M1样和M2样巨噬细胞均减少。全身免疫谱显示，CTLA4-Ig治疗组的Tregs在血液中显著减少，并在所有全身区室中相对于未治疗对照组均呈相对下降。这些发现表明，通过NICHE装置局部递送CTLA4-Ig可调节移植物部位的适应性免疫反应，最明显的抑制出现在移植后较晚时间点，但其相关的Tregs耗竭突显了CTLA4-Ig用作免疫抑制剂时的一个关键局限性。
2.5 ALS的局部递送选择性耗竭效应T细胞同时保留调节群体
ALS治疗组的CyTOF分析显示，即使在胰岛移植前（第3天），CD3+ T细胞就已减少，并且抑制持续到第14天。与未治疗对照组相比，ALS治疗抑制了适应性免疫亚群，CD4+ T细胞到第14天仍低约16%–34%，CD8+ T细胞到第30天仍低约16%–31%，其各自的效应记忆T细胞也呈现类似减少。值得注意的是，Tregs在所有时间点都表现出持续的纵向增加，约12%–67%。相应地，CTLA4+ CD4+ T细胞在所有时间点也显著增加。相比之下，CD4+ 和CD8+ T细胞的CD28+ 亚群以及颗粒酶B+ CD8+ T细胞均显著减少，表明细胞毒功能被有效抑制。B细胞在第7天减少22%，但随后相对于对照组增加。在先天免疫亚群中，树突状细胞和NK细胞减少至第30天。巨噬细胞分析显示M1样群体稳定，而M2样巨噬细胞持续增加约26%–95%，表明向抗炎巨噬细胞极化转变。全身流式细胞术显示全血、脾脏或引流淋巴结的变化极小。总之，通过NICHE平台局部递送ALS可有效耗竭效应T细胞亚群，同时保留Tregs并促进M2样巨噬细胞极化，表明其具有有利于诱导耐受的特征。
2.6 抗CD40L的局部递送选择性调节T细胞和抗原呈递细胞活性
相对于未治疗对照组，B细胞在第3天早期增加31%，随后在第30天减少20%，而树突状细胞在第14和30天减少。CD4+ 和CD8+ T细胞，包括效应记忆亚群，到第30天减少，表明抗原特异性T细胞活化减少。调节性T细胞到第14天保持不变，但在第30天增加23%，且CD4+ CTLA4+ T细胞在所有时间点均增加，表明局部免疫调节增强。CD28+ T细胞和颗粒酶B+ CD8+ T细胞减少，表明细胞毒性活化被有效抑制。巨噬细胞极化发生改变，M2样巨噬细胞到第14天短暂增加，但在第30天下降58%，而M1样亚群保持不变。全身免疫分析显示局部抗CD40L治疗后影响有限。总之，这些结果表明，通过NICHE装置进行局部CD40L阻断可减弱T细胞共刺激、细胞毒性区室和抗原呈递细胞活性，同时保留了调节性细胞群体。
2.7 抗CD2的局部递送及其免疫调节效应
与未治疗对照组相比，抗CD2治疗导致树突状细胞和NK细胞在移植后各时间点分别减少约15%–38%和16%–36%，而CD4+ 和CD8+ T细胞仅在移植后第14天减少约15%–20%。有趣的是，Treg频率在第14和30天增加22%–24%，表明调节表型富集。CD28+ T细胞亚群减少约10%–15%。颗粒酶B+ CD8+ T细胞在第7和30天减少20%–22%，表明细胞毒功能被部分抑制。在髓系群体中，M2样巨噬细胞在第7天短暂升高，但在第30天显著下降，而M1样巨噬细胞保持稳定。全身免疫分析显示各区间扰动极小。总之，抗CD2的局部递送可抑制T细胞反应，同时保留局部Tregs，并在移植后早期诱导向M2样巨噬细胞表型的短暂转变。
2.8 抗IL6的局部递送增强而非抑 制 免 疫 活 化
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