引言：髓外多发性骨髓瘤是高风险临床特征，与治疗抵抗性增强和生存期缩短相关。其肿瘤微环境（TME）的组成和免疫细胞功能状态尚未完全阐明。当前多发性骨髓瘤治疗策略日益依赖免疫疗法激活T细胞和NK细胞，而这两类细胞由功能各异的不同亚群组成。本研究旨在通过多组学单细胞技术，系统性比较EMM病灶与骨髓病灶的免疫微环境差异。
患者特征：本研究纳入了EMM患者和复发/难治性多发性骨髓瘤患者队列，在性别、分期、既往治疗线数等方面均衡。值得注意的是，EMM患者在取样时年龄更小，其骨髓中浆细胞浸润水平显著更低，但血清乳酸脱氢酶水平更高。
EMM肿瘤与骨髓多发性骨髓瘤微环境的总体组成：单细胞RNA测序和流式细胞术分析一致表明，EMM肿瘤主要由恶性浆细胞、T细胞和NK细胞构成，而骨髓样本则以中性粒细胞、T细胞、单核/巨噬细胞和红细胞前体等为主。EMM肿瘤中的效应细胞（T细胞和NK细胞）与肿瘤细胞（恶性浆细胞）的比值显著低于骨髓样本。此外，EMM肿瘤中的恶性浆细胞显示出更高的增殖活性。
scRNA-seq鉴定出多样化的T细胞和NK细胞亚群：通过对T/NK细胞区室进行深入分析，研究鉴定了14个不同的亚群，包括12个T细胞亚群和2个NK细胞亚群。后者被区分为细胞毒性较强的CD16+NK细胞和调节性功能为主的CD16-NK细胞。与骨髓相比，EMM肿瘤中CD4+T细胞的浸润有限。
EMM肿瘤中的CD8+T细胞与骨髓来源相比常更耗竭：在成对样本分析中，近一半的EMM样本显示出比其配对骨髓样本更高的T细胞耗竭评分，且高耗竭评分与细胞毒性评分呈强负相关。最耗竭的CD8+T细胞亚群（被鉴定为CD8_exhausted-like TOX）几乎只存在于EMM样本中，而细胞毒性最强的亚群在EMM中显著减少。流式细胞术结果也证实，EMM来源的T细胞表达更高的PD-1蛋白。此外，EMM和EMM_BM样本中的初始CD8+和CD4+T细胞比例也呈逐步降低趋势。
EMM肿瘤中的T细胞耗竭似乎由直接细胞间相互作用驱动：为探究EMM肿瘤中T细胞耗竭的驱动因素，研究比较了高耗竭与低耗竭样本的差异。结果显示，高耗竭组中恶性浆细胞与T/NK细胞之间更强的HLA-B:CD8A相互作用，这源于高耗竭组恶性浆细胞上HLA-B、HLA-A和HLA-C基因的表达显著上调。同时，耗竭程度最高的CD8_exhausted-like TOX细胞簇表现出更强的与肿瘤新抗原反应性T细胞相关的基因表达特征。这些发现共同提示，EMM肿瘤中观察到的T细胞耗竭可能是由T细胞与肿瘤浆细胞之间的直接相互作用所驱动。
EMM肿瘤微环境中调节性CD16阴性NK细胞比例增加：研究发现，EMM肿瘤微环境中CD16-NK细胞的比例显著高于骨髓微环境。流式细胞术和空间转录组学在独立队列中也验证了这一趋势。值得注意的是，EMM中的CD16-NK细胞有更高比例处于细胞周期的S–G2–M期，表明其存在局部增殖。此外，这些细胞显著高表达抑制性受体KLRC1（编码NKG2A蛋白），该受体通过与肿瘤细胞上的HLA-E相互作用，进一步抑制NK细胞和T细胞的抗肿瘤活性。空间转录组学分析显示，CD16-NK细胞在病灶中呈散在分布，无特定聚集模式。
比较伴与不伴EMM的多发性骨髓瘤患者的骨髓微环境差异：研究比较了EMM患者的骨髓与不伴EMM的RRMM患者的骨髓样本。如预期，EMM患者的骨髓中恶性浆细胞浸润极少。同时，EMM_BM样本中含有比例更高的高细胞毒性CD8_effector_CX3CR1 T细胞亚群，以及比例显著更低的效应记忆CD8_EM_GZMK T细胞。B细胞在EMM_BM中也呈减少趋势。这些差异可能部分反映了EMM患者骨髓中肿瘤负荷极低的状态。
讨论：本研究的发现揭示了EMM肿瘤微环境的关键特征。首先，EMM中效应细胞相对肿瘤细胞的比例极低，这可能直接影响了依赖效应细胞功能的免疫疗法（如单克隆抗体、双特异性抗体）的疗效。其次，在约半数的EMM肿瘤中发现了高比例的耗竭性、且具有肿瘤新抗原反应潜力的CD8+T细胞，其耗竭状态可能与肿瘤细胞高表达HLA-I类分子导致的持续抗原刺激有关。这为在EMM中尝试联合免疫检查点抑制剂（如抗PD-1、抗NKG2A抗体）提供了理论依据。第三，EMM肿瘤富含具有调节功能、细胞毒性较弱的CD16-NK细胞，这可能部分解释了依赖抗体依赖性细胞毒作用的药物（如抗CD38单抗达雷妥尤单抗）在EMM中疗效有限的原因。最后，研究在EMM和耗竭T细胞中均观察到NKG2A的高表达，提示靶向此通路（例如使用Monalizumab）可能是同时挽救T细胞和NK细胞功能、克服EMM治疗抵抗的潜在策略。总之，这项工作通过多维度单细胞分析，描绘了EMM独特的免疫抑制性微环境，为开发更有效的EMM治疗策略指明了方向。
