BioID蛋白质相互作用谱揭示癌细胞中PTEN缺失诱导的PI3Kβ–EPHA2相互作用
为探究PTEN缺失背景下PI3Kα和/或PI3Kβ是否形成新的相互作用，研究在PTEN缺陷的乳腺癌细胞系中进行了两种亚型的BioID邻近标记分析。结果显示，PI3Kα和PI3Kβ在PTEN缺失的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中具有不同的相互作用组，重叠部分仅约30%。在两种PTEN缺失细胞系中均与PI3Kβ特异性相关的四个相互作用蛋白中，EPHA2丰度最高，并且是唯一与PI3Kβ在质膜上共定位的蛋白。免疫共沉淀进一步验证了内源性EPHA2在PTEN缺失的BT549和HCC70细胞中与PI3Kβ相互作用，而不与PI3Kα作用。在PTEN野生型细胞中，EPHA2与两个亚型的相互作用相当，而PTEN敲除显著增强了EPHA2与PI3Kβ的相互作用，同时削弱了与PI3Kα的相互作用。相反，在PTEN缺失的BT549细胞中恢复PTEN表达则显著削弱了外源性和内源性EPHA2与PI3Kβ的相互作用。这些结果表明，PTEN缺失特异性促进了EPHA2与PI3Kβ之间更强的相互作用。
PTEN作为蛋白酪氨酸磷酸酶通过去磷酸化PI3Kβ酪氨酸-962调控PI3Kβ–EPHA2相互作用
研究进一步探究了PTEN缺失增强PI3Kβ–EPHA2相互作用的机制。除了其熟知的将PIP3转化为PIP2的脂质磷酸酶活性外，PTEN还拥有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。研究发现，在PTEN敲除细胞中，免疫沉淀的PI3Kβ的磷酸酪氨酸水平显著升高，而PI3Kα没有。在PTEN缺失的癌细胞系中重新表达野生型PTEN或脂质磷酸酶活性缺陷突变体（G129E）可显著降低PI3Kβ的酪氨酸磷酸化水平，而蛋白磷酸酶活性缺陷突变体（Y138L）或双磷酸酶活性缺陷突变体（C124S）几乎没有影响。这表明PTEN通过其蛋白磷酸酶活性调控PI3Kβ的酪氨酸磷酸化。免疫共沉淀显示PTEN与PI3Kβ相互作用，并且底物捕获突变体PTEN-C124S与PI3Kβ的结合显著强于野生型PTEN。这些发现支持PI3Kβ是PTEN的生理底物。同样，表达PTEN-WT或PTEN-G129E显著降低了PTEN缺失BT549细胞中PI3Kβ与EPHA2的相互作用，而PTEN-Y138L或PTEN-C124S则没有。这表明PTEN作为蛋白磷酸酶调控PI3Kβ磷酸化及其与EPHA2的相互作用。
为鉴定PTEN调控的PI3Kβ磷酸化位点，研究从PTEN敲除的HEK293T细胞中表达并纯化了Flag标记的PI3Kβ进行LC-MS/MS分析。该分析检测到PI3Kβ在酪氨酸962（Y962）和苏氨酸930（T930）的磷酸化，这两个位点在物种间高度保守。在无细胞去磷酸化实验中，PTEN-WT和PTEN-G129E突变体能有效去磷酸化含有磷酸化Y962的合成PI3Kβ肽段，而蛋白磷酸酶缺陷突变体PTEN-Y138L和PTEN-C124S则不能。值得注意的是，所有PTEN变体都不能去磷酸化含有pT930的肽段，表明PTEN作为一种酪氨酸磷酸酶靶向PI3Kβ的Y962。
为研究PI3Kβ这些位点的磷酸化是否影响PI3Kβ–EPHA2相互作用，研究构建了模拟非磷酸化（T930A, Y962F, T930A/Y962F）或磷酸化（T930E, Y962E, T930E/Y962E）状态的PI3Kβ突变体。在PTEN缺失的BT549细胞中，与PI3Kβ-WT相比，Y962F和T930A/Y962F突变体显著削弱了与EPHA2的相互作用，而T930A突变单独没有影响。这表明PI3Kβ-Y962的去磷酸化会削弱PTEN缺失细胞中PI3Kβ与EPHA2的相互作用。相反，在PTEN野生型的MDA-MB-231细胞中，表达磷酸模拟突变体T930E或T930E/Y962E增强了PI3Kβ与EPHA2的相互作用，而T930E突变单独没有显著影响。免疫荧光染色显示，磷酸模拟突变体PI3Kβ-Y962E主要定位于质膜并与EPHA2共定位，而非磷酸化突变体PI3Kβ-Y962F主要位于细胞质中。这些结果支持PI3Kβ-Y962磷酸化增强了其与EPHA2的相互作用，并促进了PTEN缺失细胞中PI3Kβ的膜定位。总之，这些结果表明PTEN通过调控PI3Kβ在Y962的磷酸化来控制PI3Kβ–EPHA2相互作用，PTEN的缺失通过允许PI3Kβ-Y962的持续性磷酸化促进了这种相互作用。
持续的PI3Kβ磷酸化支持PTEN缺失肿瘤的生长
为评估PTEN缺失诱导的PI3Kβ酪氨酸磷酸化在肿瘤发生中的功能重要性，研究检验了磷酸化缺陷的PI3Kβ突变体是否能在体内模拟PI3Kβ的基因敲除并抑制PTEN缺失肿瘤的生长。研究使用了源自同时缺失Pten和Trp53并敲除Pik3cb的基因工程小鼠模型（GEMM）的原发性PPB肿瘤细胞。尽管PPB细胞在体外容易生长，但它们在体内缺乏成瘤能力，这为评估各种PI3Kβ突变体的致癌功能提供了一个可操作的等基因平台。
研究用小鼠PI3Kβ-WT或磷酸化缺陷的PI3Kβ变体重构了PPB细胞。与在人类PTEN缺失癌细胞中的观察结果一致，添加回Y956F突变体（对应人类Y962F）或T924A/Y956F双突变体减少了PI3Kβ与EPHA2的结合，而T924A突变单独没有明显影响。这表明小鼠PI3Kβ-Y956的去磷酸化损害了小鼠PTEN缺失肿瘤中PI3Kβ与EPHA2的相互作用。
为在体内评估这种相互作用的功能后果，研究将工程化的PPB肿瘤细胞原位移植到FVB小鼠的乳腺脂肪垫中。虽然PI3Kβ-WT恢复了PPB细胞的成瘤潜力，但Y956F和T924A/Y956F突变体恢复肿瘤生长的能力显著减弱，并伴有Ki67染色减少，表明增殖受损。这些结果表明PI3Kβ的磷酸化对PTEN缺失的乳腺肿瘤生长至关重要。
研究将这一分析扩展至PTEN缺失的前列腺癌模型PC3细胞。在敲低内源性PI3Kβ后，研究过表达了野生型或非磷酸化的人类PI3Kβ突变体（T930A, Y962F, 或 T930A/Y962F），并将这些工程化的PC3细胞移植到Balb/c裸鼠体内。虽然PI3Kβ-WT促进了强劲的肿瘤生长，但Y962F和T930A/Y962F突变体大大降低了这种效果。一致地，表达Y962F或T930A/Y962F双突变体的肿瘤显示Ki67水平显著降低。总之，这些数据表明，在多种PTEN缺陷癌症模型的体内肿瘤发生中，PI3Kβ的酪氨酸磷酸化至关重要。
PI3Kβ-Y962磷酸化升高与人类乳腺癌和前列腺癌患者的PTEN缺失密切相关
为评估PTEN介导的PI3KβY962磷酸化，研究开发了一种特异性识别人PI3Kβ在Y962磷酸化的多克隆抗体，该抗体也能与对应的小鼠位点（pY956）发生交叉反应。通过蛋白质印迹和免疫荧光测定验证，该抗体可选择性检测多个细胞系中过表达和内源性的p-PI3KβY962。
研究接下来评估了PTEN表达与p-PI3KβY962水平之间的关系。使用靶向5‘-非翻译区的shRNA沉默内源性
