胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最具侵袭性和致命性的原发性脑部恶性肿瘤，即便经过数十年研究，患者的预后依然严峻，中位生存期仅约15个月。其顽固性很大程度上源于肿瘤内部存在的一小群具有自我更新和耐药能力的细胞——胶质瘤干细胞（GSC）。这些GSC栖息在特殊的血管周微环境中，那里的内皮细胞和胞外基质为它们提供了关键的生存、维持和抵抗治疗的信号。然而，传统的实验室模型，无论是二维培养还是简单的三维球体，都无法精确模拟这个复杂的、包含功能性血管网络和大脑特异性胞外基质的“生态位”，这严重制约了我们对GBM发病机制的深入理解和有效疗法的开发。面对这一挑战，迫切需要一种能够更真实地再现GBM病理生理学特征的新型体外模型。
为了建立这样一个模型，研究人员开展了一项系统性研究，并将成果发表在《Advanced Science》期刊上。他们开发了一个模块化的、生理相关的GBM研究平台。这个平台的核心是从患者肿瘤中分离出的GSC，代表着不同的分子亚型（文中使用的pGSC代表经典型/前神经元型，mGSC代表间充质型）。研究人员首先将GSC培养在基质胶中形成球体（Matrigel spheroids），这些球体能够随时间发展，逐渐展现出器官样体的特性。随后，他们设计并合成了一种工程化胞外基质（eECM），其硬度和成分（包含明胶甲基丙烯酰[GelMA]、透明质酸甲基丙烯酰[HAMA]和纤连蛋白）旨在模拟复发GBM所处的僵硬、纤维化的肿瘤微环境。最后，研究者将这个系统与内皮细胞（EC）进行共培养，以引入血管信号。通过这一系列精巧的构建，他们将患者来源的GSC、血管微环境线索和可调节的物理化学基质整合在一起，创造了一个能够动态模拟GBM复杂性的体外系统。
为构建并验证此模型，研究团队运用了多项关键技术。首先是患者来源GSC的三维培养与表征，利用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测亚型特异性（如OLIG2, STAT3）和促血管生成（如VEGFA）标记物的基因表达。其次是复杂的细胞共培养技术，通过Transwell系统将预先形成的GSC基质胶球体与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行间接共培养，以研究细胞间的旁分泌相互作用。再者是工程化生物材料的开发与表征，合成并优化了基于GelMA和HAMA的eECM，并通过流变学和力学测试对其成胶动力学、储存模量（G‘）和压缩模量进行精确调控，以模拟目标刚度（约200-400 kPa）。最后是全面的表型分析，利用免疫荧光染色对固定在球体或封装在eECM中的样本进行多重标记，以量化干性（CD133）、增殖（Ki67）、缺氧（CAIX）以及向星形胶质细胞（GFAP）、少突胶质细胞（MOG）、周细胞（CD248）和内皮细胞（CD31）分化的能力，并通过图像分析软件进行定量。
研究结果
2.1 建立和表征GSC基质胶球体系统
为了建立GSC球体系统，研究者首先对两种亚型GSC在单层、球体及基质胶球体培养条件下的基因表达谱进行了分析。qRT-PCR结果显示，在三维培养条件下，特别是基质胶球体中，两种GSC的亚型特异性标记物（pGSC的OLIG2和BCAN，mGSC的STAT3和RUNX2）以及促血管生成基因（VEGFA和FGF2）的表达均随着培养时间（从第3天到第14天）显著增强。这表明三维基质胶环境为维持GSC的亚型特征和促血管生成能力提供了更适宜的微环境。
2.2 内皮细胞共培养增强GSC基质胶球体的干性、增殖和缺氧
通过免疫荧光染色，研究者评估了与内皮细胞（EC）共培养对GSC功能状态的影响。结果表明，与EC共培养显著增强了两种GSC亚型的干性标记物CD133、增殖标记物Ki67以及缺氧标记物CAIX的表达。这些效应在长达14天的共培养中尤为明显，且间充质型mGSC的增殖反应比前神经元型pGSC更为强烈。这证实了内皮来源的信号是调节GSC关键恶性表型的主动因素，强调了在模型中纳入血管成分的必要性。
2.3 与内皮细胞共培养促进GSC球体的谱系分化
研究人员进一步检测了GSC在不同微环境下向多种神经胶质细胞和血管支持细胞分化的潜力。免疫荧光分析显示，在基质胶中培养，特别是在与EC共培养的条件下，两种GSC都表现出更强的多谱系分化能力。pGSC主要倾向于分化为星形胶质细胞（GFAP+），而mGSC则显示出更广泛的分化潜能，包括向少突胶质细胞（MOG+）、周细胞（CD248+）和内皮样细胞（CD31+）分化。这些结果揭示，GSC基质胶球体在血管微环境信号的引导下，能够动态地发展成为包含干细胞和多种分化细胞的异质性类器官结构。
2.4 开发GBM相关的工程化胞外基质
为了模拟复发GBM的僵硬微环境，研究者开发了一种eECM。通过调整GelMA的浓度和“Bloom”强度，并掺入HAMA和纤连蛋白，他们最终优化出一种配方（12.5% GelMA Bloom 100, 1.5% HAMA 10K, 15 µg/mL纤连蛋白），其压缩模量约为309 kPa，位于目标刚性范围（200-400 kPa）内。该基质在培养液中能保持超过14天的结构稳定性，适合中长期细胞培养研究。
2.5 在eECM中封装GSC基质胶球体并在内皮细胞存在下增强增殖和分化
最后，研究者将培养了两周的GSC基质胶球体封装到上述eECM中，并继续在有或无EC共培养的条件下维持。形态学观察显示，封装在eECM中的球体边界更清晰，结构更致密。表型分析表明，在eECM封装条件下，与EC共培养依然能显著促进GSC的增殖（Ki67）和分化（GFAP, CD248, CD31），同时干性标记物CD133保持稳定。这证明了该eECM平台不仅能模拟GBM的力学特征，还能支持在生理相关背景下研究GSC与血管的相互作用。
结论与讨论
本研究成功构建了一个高度模块化且生理相关的胶质母细胞瘤体外模型。该模型整合了患者来源、具有亚型异质性的胶质瘤干细胞，可模拟血管周生态位信号的内皮细胞，以及一个力学性能可调、能再现复发肿瘤僵硬微环境的工程化胞外基质。核心发现是，内皮细胞的共培养是驱动GSC关键恶性表型（包括干性维持、增殖、缺氧适应和多谱系分化）的强大刺激因素。而封装在定制化eECM中，则为在模拟疾病状态的力学背景下研究这些过程提供了可能。
这项研究的深刻意义在于它巧妙地弥合了简单体外模型与复杂体内环境之间的鸿沟。传统的二维或单纯的三维球体模型无法捕捉肿瘤微环境中细胞与细胞、细胞与基质之间错综复杂的相互作用，而这些相互作用正是治疗耐药和肿瘤复发的根源。本研究开发的平台不仅能够更真实地模拟这些相互作用，还具有可调节和可扩展的优势。eECM的刚度、成分可以调整，以模拟从初诊到复发等不同疾病阶段；不同的细胞类型（如小胶质细胞、神经元）可以引入，以增加微环境的复杂性；该平台还适用于高通量药物筛选，在更接近人体实际状况的环境中评估新疗法的效果。因此，这项工作不仅增进了我们对GBM血管周微环境如何调控肿瘤干细胞行为的基本理解，也为未来开发针对该生态位的精准治疗策略，以及实现个体化医疗提供了强大的转化研究工具。
