在神经科学领域，有一种疾病如同冰封的火焰，缓慢而残酷地夺走患者的行动与呼吸能力，它就是肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS），又称“渐冻症”。这是一种罕见、进行性且致命的神经退行性疾病，主要攻击大脑和脊髓中的运动神经元，导致进行性肌肉无力和萎缩，最终因呼吸衰竭而死亡。尽管其病因复杂，但科学家们逐渐认识到，细胞内的“清洁站”——溶酶体的功能紊乱，是驱动ALS等神经退行性疾病发展的一个核心病理环节。溶酶体负责降解和回收细胞废物，其功能障碍会导致有毒蛋白聚集，加速神经元死亡。
在细胞内部，有一位名为转录因子EB（Transcription Factor EB, TFEB）的“总指挥”，它主导着溶酶体的生物合成。激活TFEB，使其从细胞质转移至细胞核（即核转位），从而启动溶酶体相关基因的表达，被认为是恢复疾病和衰老中溶酶体功能的一种有前景的治疗策略。然而，传统的TFEB激活策略，例如通过抑制雷帕霉素复合物1（mTORC1）来促进TFEB核转位，存在一个显著的弊端。mTORC1本身是细胞感知营养、调控代谢、生长和免疫稳态的关键调节器，长期抑制它可能干扰这些基本细胞过程，带来潜在的不良反应。因此，开发能够不依赖mTORC1、以更精准方式激活TFEB的新型药物，成为领域内亟待解决的难题。
近年来，人工智能（AI）技术的突飞猛进，为药物发现带来了革命性的工具。能否利用AI大海捞针，从数百万化合物中快速锁定那些能绕过mTORC1、直接激活TFEB的“神奇分子”呢？一项发表在《Pharmacological Research》上的研究给出了肯定的答案，并揭示了一个源于古老植物银杏的天然化合物所蕴藏的治疗潜能。
为了开展这项研究，研究人员整合运用了多项关键技术。他们首先构建了人工智能驱动的配体与结构双虚拟筛选工作流程，从一个超过115万种化合物的大型商业库中筛选候选分子。在细胞和分子水平，研究采用了包括免疫印迹、细胞热转移分析、等温滴定量热法、体外激酶活性测定在内的多种生化与生物物理技术，以验证化合物与靶点的结合及作用机制。利用患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）分化得到运动神经元，作为疾病模型，并结合LysoTracker Red和DQ-BSA-Red等荧光探针检测溶酶体功能。此外，研究还使用了来自荷兰脑库的ALS患者死后脑组织样本进行验证。通过点突变构建、分子对接模拟以及动力学分析等手段，深入阐明了化合物的精确作用位点与抑制类型。
虚拟筛选鉴定出潜在的mTOR非依赖性TFEB核转位激动剂
研究人员建立了一个结合AI驱动配体虚拟筛选和GPU加速结构虚拟筛选的工作流程。他们以15个已知的mTOR非依赖性TFEB激动剂为参考，从一个包含1,155,606个化合物的大库中，基于结构相似性筛选出1745个候选化合物。随后，将这些化合物与908个自噬-溶酶体通路相关蛋白进行大规模交叉对接分析，排除与mTOR有潜在亲和力的分子，最终根据对接评分遴选出前20名候选化合物。值得注意的是，其中四种化合物——银杏双黄酮、异银杏双黄酮、Isoginkgetin (ISO)和罗汉松双黄酮，均属于源自银杏的3'-8''-双黄酮家族。细胞实验证实，这四种化合物均能显著促进TFEB-EGFP HeLa细胞中TFEB的核转位。
ISO促进mTORC1非依赖性的TFEB核转位
研究人员将焦点集中于ISO。细胞成像和免疫印迹实验表明，ISO能以剂量依赖的方式促进TFEB核转位，并增加核内TFEB蛋白水平。关键的是，ISO处理并不影响mTORC1下游底物（如磷酸化ULK1、p70 S6激酶和4E-BP1）的磷酸化水平，且即使将TFEB上受mTORC1调控的S122和S211位点突变为模拟磷酸化的天冬氨酸，ISO诱导核转位的能力依然存在，这证实了ISO激活TFEB不依赖于mTORC1。此外，ISO处理提升了溶酶体膜蛋白标记物LAMP2以及成熟组织蛋白酶B、D的表达水平，并通过LysoTracker Red和DQ-BSA-Red染色证实，ISO增加了功能性溶酶体的数量并增强了溶酶体水解酶活性。
ISO在体外和体内均抑制GSK-3β活性
为了探究ISO的作用靶点，研究者结合在线靶点预测工具SwissTargetPrediction和热蛋白质组学分析（TPP），共同锁定了一个关键靶点：糖原合酶激酶3β（Glycogen Synthase Kinase 3β, GSK-3β）。GSK-3β可通过直接磷酸化TFEB的S134和S138位点使其保持失活状态。等温滴定量热法和细胞热转移分析证实ISO能直接结合GSK-3β蛋白。体外激酶实验显示ISO可抑制GSK-3β活性（IC50= 16.97 μM）。细胞实验中，ISO降低了GSK-3β下游底物磷酸化β-连环蛋白和c-Myc的水平，并减少了TFEB的体内磷酸化。更重要的是，将TFEB的S134和S138位点突变为天冬氨酸以模拟GSK-3β的磷酸化后，ISO诱导TFEB核转位的能力被阻断。
ISO竞争性结合GSK-3β激酶的ATP口袋
通过构建GSK-3β截短体，研究者发现其激酶结构域对ISO发挥作用至关重要。分子对接显示，ISO与GSK-3β激酶结构域中位于ATP结合口袋内的Lys85、Tyr134和Asp200氨基酸残基形成氢键。其中，Lys85突变会显著削弱ISO与GSK-3β的结合力。动力学实验和Lineweaver-Burk作图分析表明，ISO是GSK-3β的ATP竞争性抑制剂。体外激酶实验也证实，补充高浓度ATP可以逆转ISO对GSK-3β活性的抑制。进一步的功能实验显示，GSK-3β的Lys85突变体失去了促进其下游底物降解的能力，也无法阻断ISO诱导的TFEB核转位，说明Lys85是ISO发挥作用的关键结合位点。
ALS运动神经元中的溶酶体功能障碍
研究团队在来自荷兰脑库的ALS患者脑组织样本中，检测到LAMP2和成熟组织蛋白酶B的表达降低，提示存在溶酶体功能障碍。为了在更精确的模型中验证，他们利用来自健康对照和ALS患者（携带TARDBP或SOD1基因突变）的诱导多能干细胞（iPSC）分化为MAP2+/HB9+运动神经元。在这些iPSC来源的ALS运动神经元中，同样观察到了LAMP2和成熟组织蛋白酶B表达的减少。通过Syn::EGFP报告系统标记运动神经元，并利用荧光探针染色，研究发现与健康对照相比，ALS运动神经元中功能性溶酶体的数量和溶酶体水解酶活性均显著下降，这共同证实了ALS运动神经元中存在溶酶体功能障碍。
ISO通过GSK-3β–TFEB信号轴改善溶酶体功能并拮抗ALS样病理
最后，研究评估了ISO对ALS运动神经元的治疗潜力。在四种不同类型的ALS运动神经元中，ISO处理能促进TFEB核转位，降低磷酸化β-连环蛋白水平，并上调LAMP2和成熟组织蛋白酶B的表达，说明ISO在运动神经元中同样激活了GSK-3β–TFEB轴。LysoTracker Red和DQ-BSA-Red染色证实，ISO处理提升了ALS运动神经元中功能性溶酶体的数量和活性。此外，ISO治疗还能显著减少ALS运动神经元轴突的串珠样肿胀，降低乳酸脱氢酶（LDH）的释放，并增加存活Syn::EGFP标记的运动神经元数量。而过表达GSK-3β则会阻断ISO引起的溶酶体蛋白上调和神经保护作用。这些结果表明，ISO通过增强溶酶体生物合成和功能，能够有效拮抗ALS运动神经元中的病理表型。
研究结论与意义
本研究成功地利用人工智能驱动的虚拟筛选平台，从银杏中鉴定出天然化合物Isoginkgetin (ISO)作为一种新型的、mTORC1非依赖性TFEB激动剂。研究系统阐明了其作用机制：ISO作为GSK-3β的ATP竞争性抑制剂，通过结合其ATP口袋中的关键Lys85残基，抑制GSK-3β激酶活性，从而减少其对TFEB的磷酸化抑制，促进TFEB核转位，最终增强溶酶体生物合成与功能。在源自ALS患者的iPSC运动神经元模型中，ISO展现出了显著的神经保护作用。
该研究的结论具有重要意义。首先，它从机制上证实了通过药物手段（如使用ISO）纠正溶酶体功能障碍，是治疗ALS的一个可行策略，为这种难治性疾病提供了新的治疗思路和候选药物。其次，研究揭示了一条不依赖mTORC1、通过靶向抑制GSK-3β来激活TFEB的全新信号轴（GSK-3β–TFEB轴），为开发选择性更高、副作用可能更小的TFEB激活剂指明了方向。再者，ISO作为一种天然产物，其独特的与GSK-3β ATP口袋中Lys85结合的特性，为设计下一代GSK-3β抑制剂提供了新颖的先导化合物结构参考。最后，这项研究是AI技术加速神经退行性疾病新药发现的成功范例，展示了整合计算虚拟筛选与湿实验验证的强大效率与潜力，为未来针对复杂疾病通路进行药物研发提供了可借鉴的范式。尽管研究也存在一些局限性，如虚拟筛选对已知化合物结构的依赖、ISO可能存在的其他靶点等，但它无疑为攻克ALS及其他涉及溶酶体功能障碍的神经退行性疾病带来了新的希望。
