通过定向进化提升APEX2介导的邻近依赖性RNA标记的催化效率，并揭示中期体邻近转录组及ANLNmRNA的协同翻译靶向机制

为解决APEX2对新型高活性探针（如生物素-苯胺，Btn-An）催化效率不足的问题，研究人员通过酵母表面展示定向进化，获得了活性提升约2倍的L242FAPEX2突变体。结合5 mM Btn-An，该工具能以更高的效率和空间特异性进行超快速（10秒）邻近标记。应用于中期体邻近转录组分析，成功鉴定出包括ANLN在内的新定位mRNA，并发现ANLNmRNA通过其新生N端多肽的协同翻译机制靶向中期体。该研究为复杂亚细胞环境下的高时空分辨率转录组学提供了强大工具。

理解细胞内特定细胞器或亚细胞结构的分子组成和调控机制，是窥探生命活动精细调控的关键。然而，这些结构通常微小而动态，传统生化方法难以精确捕捉其“邻里关系”。近年来，工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX/APEX2）作为一种革命性的邻近标记工具，通过在目标蛋白附近产生短寿命的自由基来“标记”周围的生物分子，为绘制高时空分辨率的亚细胞蛋白质组和转录组图谱提供了可能。然而，随着新型、活性更高的标记探针（如生物素-苯胺，Btn-An）被开发出来，原有的APEX2酶对这些“新武器”的催化效率并不理想，限制了其应用潜力。如何让酶与探针更高效地协同工作，以实现更灵敏、更快速的邻近标记，成为领域内亟待解决的问题。

本项研究正是为了破解这一难题。研究团队通过巧妙的定向进化策略，成功改造了APEX2，大幅提升了对Btn-An探针的标记效率。他们将这个升级版工具应用于具有挑战性的细胞分裂结构——中期体，绘制了其邻近转录组图谱，并深入揭示了一个关键mRNA定位到中期体的全新机制。这项研究成果已发表于国际知名期刊《Advanced Science》。

为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：1. 酵母表面展示定向进化：构建APEX2随机突变库，在酵母表面进行展示，并利用生物素-苯胺（Btn-An）探针进行多轮荧光激活细胞分选（FACS），筛选高活性突变体。2. 哺乳动物细胞稳定表达与CRISPR/Cas9基因敲入：在HEK293T细胞中构建稳定表达线粒体、内质网膜（ERM）或细胞质靶向APEX2变体的细胞系，并利用CRISPR/Cas9技术将^L242FAPEX2精确敲入内源性中期体蛋白（KIF23和BIRC5）的基因位点。3. 基于链霉亲和素的亲和纯化与高通量测序：对APEX2介导标记的生物素化RNA进行富集，随后进行RNA测序（RNA-seq），以分析特定亚细胞区域的转录组。4. 单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）成像：用于在单细胞水平可视化并定量验证特定mRNA（如ANLN）的亚细胞定位。

研究结果

2.1 针对Btn-An探针的APEX2定向进化以获得更高标记强度

研究首先比较了多种探针在哺乳动物细胞和酵母表面的标记活性，确认APEX2对Btn-An的催化效率有待优化。随后，研究人员通过酵母表面展示平台，对APEX2进行随机突变并利用Btn-An探针进行四轮FACS筛选，成功获得了活性显著提升的突变体^L242FAPEX2。流式细胞术分析显示，其对Btn-An的标记活性比野生型APEX2提高了约0.5个数量级。结构分析表明，L242位点位于APEX2 C末端的α螺旋，朝向血红素附近的底物结合口袋，引入芳香族侧链的苯丙氨酸可能通过π-π相互作用增强酶与底物的结合。

2.2 ^L242FAPEX2突变体在哺乳细胞中的表征

在稳定表达线粒体靶向APEX2变体的HEK293T细胞中，^L242FAPEX2对Btn-An和传统底物生物素-苯酚（Btn-Ph）的蛋白标记强度均有提升，其中对5 mM Btn-An的标记效率提高了近2倍。该突变体还表现出更强的过氧化氢（H₂O₂）耐受性。值得注意的是，^L242FAPEX2在使用5 mM Btn-An时，仅需10秒的H₂O₂处理即可实现高效生物素化，为快速动态过程研究提供了可能。

2.3 ^L242FAPEX2突变体对RNA的更高标记效率

将^L242FAPEX2靶向至内质网膜（ERM）后，RT-qPCR分析显示，与APEX2相比，^L242FAPEX2对膜蛋白编码mRNA（如CANX, SSR2）的标记回收率有1.5至2.2倍的提升，证实了其更高的RNA标记效率。

2.4 使用^L242FAPEX2分析内质网膜邻近转录组

利用^L242FAPEX2-ERM与^L242FAPEX2-NES（细胞质靶向）细胞系的对比RNA-seq分析，研究鉴定出1136个显著富集于ERM的转录本，其中96%为编码分泌通路蛋白的基因，其覆盖度和特异性与已有的邻近标记方法（如邻近特异性核糖体图谱、CAP-seq）相当，验证了该方法的高空间特异性。

2.5 使用^L242FAPEX2分析中期体邻近转录组

研究人员通过CRISPR/Cas9技术，将^L242FAPEX2-EGFP敲入内源性中期体蛋白KIF23和BIRC5的C端，构建了在细胞分裂后期特异性定位于中期体的细胞系。在同步化至分裂后期的细胞中进行10秒快速标记和RNA-seq，通过对比标记样本与未加H₂O₂的对照样本，分别鉴定出1530个（KIF23融合）和863个（BIRC5融合）显著富集的RNA。两者的交集包含767个RNA，被定义为中期体邻近转录组。基因本体（GO）分析显示，这些RNA编码的蛋白显著富集于中期体相关结构和有丝分裂调控过程。

2.6 ANLNmRNA向中期体的翻译依赖性靶向

从中期体邻近转录组中，研究通过smFISH验证了ANLN（Anillin）mRNA是HEK293T细胞中一个新的中期体定位转录本，并发现其定位具有细胞周期动态性。进一步的药物扰动实验发现，破坏多核糖体的嘌呤霉素和 Harringtonine 能显著削弱ANLNmRNA的中期体定位，而稳定多核糖体的环己酰亚胺则无影响，表明其定位依赖于新生多肽链的协同翻译机制。

2.7 ANLNmRNA定位需要N端新生多肽

通过构建一系列EGFP报告基因mRNA，研究发现ANLN的编码区（CDS），而非其非翻译区（UTR），是其靶向中期体所必需的。系统性删除实验进一步表明，其N端与Formin蛋白结合的区域（2-149位氨基酸）是mRNA定位的必要条件，但该区域自身并不足以驱动异源报告mRNA定位，提示需要完整的CDS或其他高级结构特征。

结论与讨论

本研究成功通过定向进化获得了对高活性探针Btn-An催化效率显著提升的APEX2突变体^L242FAPEX2。该变体与5 mM Btn-An的组合，实现了高效、快速（10秒）且高空间特异性的邻近标记，将APEX技术的灵敏度推向了新高度。利用这一强大工具，研究团队不仅成功绘制了内质网膜的高质量邻近转录组图谱，更挑战性地解析了细胞分裂过程中短暂存在的致密结构——中期体的邻近转录组，发现了包括ANLN在内的767个邻近RNA。

更为重要的是，研究深入揭示了ANLNmRNA靶向中期体的新颖机制：这是一个依赖于其自身编码的新生多肽的协同翻译过程，其N端的Formin结合区域在这一过程中起关键作用。这一发现丰富了我们对mRNA亚细胞定位机制的理解，提示对于有丝分裂相关结构，通过mRNA的协同翻译靶向来快速募集大型支架蛋白可能是一种高效策略。

总之，该工作不仅为空间分辨转录组学研究提供了一个性能卓越的升级版工具（^L242FAPEX2），有望广泛应用于各种复杂亚细胞环境，其揭示的协同翻译mRNA定位新机制也为细胞生物学基础研究提供了新的见解。10秒超快标记的能力，更使其在捕捉信号通路快速互作组重组等动态过程中具有巨大应用潜力。