摘要：脊椎动物复杂脑所含的细胞类型比其近缘类群更多。早期脊椎动物演化过程中发生过全基因组倍增（whole-genome duplication, WGD），但倍增产生的重复基因（ohnologues，全基因组倍增保留旁系同源基因）是否促进了细胞类型演化尚不清楚。本研究利用五种脊索动物——人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）、蜥蜴（Pogona vitticeps）、七鳃鳗（Petromyzon marinus）和文昌鱼（Branchiostoma floridae）的脑单细胞转录组数据，研究人员发现脊椎动物中具有保守核心转录因子（transcription factor, TF）的许多细胞类型家族与文昌鱼并不呈一对一同源关系。此外，ohnologues（尤其来自第一次WGD者）比小规模倍增（small-scale duplication, SSD）旁系同源基因对脊椎动物细胞类型演化更为重要。为探究ohnologues是否在机制上对细胞类型演化起重要作用，研究人员预测祖先细胞类型状态并与文昌鱼比较，并对大胶质细胞（macroglia）进行实验验证。研究结果表明ohnologues参与了早期脊椎动物细胞类型多样化过程。此外，通过分析旁系同源基因在不同细胞类型和物种间的表达，研究人员发现表达变化主要由剂量选择（dosage selection）和亚功能化（subfunctionalization）驱动。研究人员还将ohnologues与不同解剖及细胞类型尺度上的细胞多样性联系起来。本研究结果表明WGD对早期脊椎动物脑复杂性演化具有重要作用，且产生的ohnologues在全基因组倍增发生后很长一段时间内持续促进细胞类型演化。
研究背景与立项依据
脊椎动物拥有高度区域化与复杂的脑结构，其脑细胞类型多样性显著高于近缘的无脊椎脊索动物（如尾索类和头索类文昌鱼）。早期脊椎动物演化中发生过两轮全基因组倍增（2R假说，即1RV与2R），但WGD产生的ohnologues是否以及如何驱动脑细胞类型起源与多样化一直未明。已有研究证实细胞类型可通过"姐妹细胞类型模型"（即基因/细胞复制与分化）产生，而旁系同源基因可经亚功能化（互补退化突变保留）或新功能化（neofunctionalization）分化，但WGD衍生ohnologues与SSD（小规模DNA片段倍增）旁系同源基因在细胞类型演化中相对贡献不明，且脊椎动物脑细胞类型家族的祖先调控程序也未被系统解析。本研究旨在通过比较五类脊索动物全脑单细胞转录组，阐明WGD与SSD旁系同源基因对脑细胞类型家族起源、分化及区域特化的作用及分子机制。该论文发表于《Nature》。
主要关键技术方法
研究人员整合并重新分析人、小鼠、蜥蜴、七鳃鳗及新生成年文昌鱼脑的单细胞（scRNA-seq）与单细胞核（snRNA-seq）转录组队列，经标准化预处理与迭代聚类进行细胞类型注释；采用SAMap进行跨物种细胞类型映射；利用OrthoFinder与Ohnologs v2.0鉴定ohnologues与SSD旁系同源基因；应用NS-Forest鉴定细胞类型家族特异性转录因子（TF）及保守核心调控复合体（CoRC）基因；使用pySCENIC推断基因调控网络与regulon；以Fisher精确检验分析ohnologues/SSD旁系同源基因在差异表达基因（DEG）中的富集；基于Ka/Ks与基因树估算旁系同源基因倍增年代；通过推断祖先二值化表达状态量化亚功能化与新功能化比例；在文昌鱼中通过CRISPR-Cas9构建SoxE敲除系，结合杂交链式反应荧光原位杂交（HCR–FISH）、RNA速率（RNA velocity）及单细胞胚胎批量RNA-seq验证胶质细胞发育中SoxE及其ohnologues的作用；另独立分析羊膜动物小脑核（cerebellar nucleus, CN）单细胞数据集以评估ohnologues对近期细胞类型多样性的影响。
研究结果
New vertebrate brain cell-type families（新的脊椎动物脑细胞类型家族）
研究人员将五个物种脑细胞分别聚类注释为神经元与非神经元细胞类型家族，经SAMap跨物种映射发现脊椎动物多数细胞类型家族共享保守TF程序（如Homeodomain TFs），但与文昌鱼无严格一对一同源，文昌鱼胶质细胞共表达分隔于脊椎动物不同大胶质细胞类型中的TF（如SoxE与Olig），提示脊椎动物脑细胞类型家族起源于脊椎动物干系经特定TF程序分化，且在脊椎动物中保守。
WGD versus SSD in cell-type diversity（WGD与SSD旁系同源基因在细胞类型多样性中的作用比较）
Fisher精确检验显示ohnologues在细胞类型家族差异表达基因（DEG）中显著富集，而SSD旁系同源基因呈负富集；该现象在α谱系ohnologues（来自种间杂交WGD模型中的α亲本谱系）中最显著，古老SSD略强于近期SSD但仍弱于ohnologues。基因本体（GO）分析表明ohnologues富集于发育、细胞命运决定、信号转导及神经递质转运，SSD旁系同源基因富集于免疫应答与感觉感知；ohnologue家族更倾向保留TF、辅因子及转运蛋白。若某旁系同源基因为某细胞类型标记基因，其同源拷贝通常不在此细胞类型中同为标记；在姐妹细胞类型（如星形胶质细胞与室管膜细胞，星形胶质细胞与少突胶质细胞前体细胞/少突胶质细胞）中，通常仅其中一种细胞类型使用一个旁系同源拷贝作标记，而非姐妹细胞各用不同拷贝。
Linking WGD to cell-type evolution（将WGD与细胞类型演化相关联）
以大胶质细胞为模型，跨物种TF表达树显示文昌鱼胶质细胞共表达SoxE与Olig，类似于脊椎动物放射状胶质前体；HCR–FISH与RNA velocity证实文昌鱼CNS胶质细胞中SoxE与OligB共定位且有向低Olig表达状态的分化轨迹，具备多能性特征。SoxE敲除文昌鱼胚胎胶质标记基因下调但无严重形态缺陷（区别于脊椎动物Sox9/Sox10敲除表型）。由此推断祖先脊索动物胶质细胞共表达SoxE/Olig/Nfia-Nfib，WGD后SoxE ohnologues（Sox9、Sox10、Sox8）与Olig ohnologues发生亚功能化分别限定星形胶质细胞与少突胶质细胞命运，支持"WGD-first模型"（WGD先于细胞类型个体化，ohnologues经剂量选择与亚功能化分配至不同姐妹细胞类型），而非"细胞复杂性优先模型"。
Subfunctionalization and neofunctionalization（亚功能化与新功能化）
比对四物种ohnologue与SSD旁系同源基因家族祖先表达状态（基于≥3/4物种标记基因推断），约78%旁系同源表达变化归因于亚功能化（祖先共表达域分裂至不同拷贝），约21%为新功能化（获得新表达域），＜1%为功能丢失；该比例在ohnologues与SSD旁系同源基因中一致，支持DDC（duplication–degeneration–complementation）模型。以T-br1/T-box ohnologue家族为例，Tbr1特异地在端脑谷氨酸能神经元表达，Eomes在菱脑谷氨酸能神经元表达，显示ohnologues表达域分化。
Dosage selection across cell types（跨细胞类型的剂量选择）
＞65%的ohnologue与SSD旁系同源基因家族中存在显著表达量或表达细胞比例占优的"主导拷贝"，且ohnologue家族共享主导拷贝的比例高于SSD家族，不同脊椎动物间具保守性（人与小鼠最高），符合基因平衡假说——WGD后立即受剂量选择作用使ohnologues得以保留直至亚功能化/新功能化。实例中PAX6在各脑细胞类型高表达而PAX4局限表达，且跨物种一致。
Genome duplication and regional identity（基因组倍增与区域身份）
分析显示ohnologues显著关联星形胶质细胞与少突胶质细胞亚型DEG，参与脑区（端脑、间脑、中脑、菱脑）特异性身份基因（如Foxg1等）多为ohnologues且拷贝数扩张，这些区域化调控程序在脊椎动物间保守但在文昌鱼缺乏对应。表明WGD后ohnologues经表达偏移参与脊椎动物脑细胞类型家族在不同脑区的区域特化。
Lasting effect of WGD on cell types（WGD对细胞类型的持久影响）
分析羊膜动物小脑核（CN）兴奋性神经元（WGD后1.5亿年以上才出现CN复制与扩增）发现ohnologues仍显著富集于CN亚型DEG，保守TF ohnologues（Lmx1a、Tbr1、Lhx9、Foxp1/2、Nr2f1/2等）差异化表达界定CN各亚核兴奋性神经元亚型，轴突导向分子ohnologues亦参与。说明WGD产生的ohnologues在远古WGD事件发生数亿年后仍驱动较新细胞类型（如CN亚型）的复制与分化。
讨论与结论（翻译）
研究人员发现大多数主要脊椎神经细胞类型家族起源于脊椎动物祖先——即与文昌鱼分化之后、圆口类与颌口类分化之前；除较高层级的胶质细胞外，脊椎动物与文昌鱼通常缺乏严格一对一细胞类型同源关系。较古老的SSD旁系同源基因比较小较新的SSD旁系同源基因更易成为细胞类型标记，但无论基因年龄如何，ohnologues比SSD旁系同源基因更倾向作为标记基因。跨物种比较表明亚功能化是两类旁系同源基因演化的主导模式，与DDC模型及基因平衡假说相符。细胞类型保守性涵盖脊椎动物但不涵盖文昌鱼，这与早于七鳃鳗的第一次WGD（1RV）相关，且第一次WGD贡献ohnologues多于第二次WGD（2R）。ohnologues作为细胞类型标记基因的显著关联及其对发育调控基因（特别是TF）的偏好性富集，指示其对细胞类型演化的重要性。文昌鱼数据显示祖先细胞类型共表达TF家族成员，WGD后经ohnologues功能偏离实现姐妹细胞类型个体化（WGD-first模型）。以大胶质细胞为例，祖先脊索动物放射状胶质共表达SoxE、Olig及Nfia/Nfib/Nfix，WGD后SoxE ohnologues功能性分化促成新细胞类型（星形胶质细胞与少突胶质细胞等）个体化；文昌鱼SoxE突变体表型轻微不同于脊椎动物同类敲除，反映祖先TF广泛共表达特征。综上所述，早期脊椎动物WGD（尤第一次WGD）在脊椎动物脑细胞类型起源及脑复杂性演化中发挥重要作用，第二次WGD（在颌口类中）也有追加贡献但程度较小；且该效应在WGD后数亿年仍持续，ohnologues对羊膜动物较新细胞类型（如CN亚型）多样性同样重要。研究人员认为此影响可能超越脑组织，是早期脊椎动物WGD的普遍后果。
