BRAF功能获得性突变特别是BRAF(V600E)约占所有结直肠癌(CRC)患者的10%，预后差且治疗手段有限。BRAF抑制剂如Encorafenib因BRAF二聚化驱动的MAPK通路再激活而无效。尽管BRAF与EGFR联合抑制是获批疗法，但生存获益短且易产生治疗耐药与复发。本研究通过理性化学文库设计结合并行蛋白质组学筛选，鉴定出dHuR是一类靶向RNA结合蛋白人抗原R(HuR/ELAVL1)的分子胶降解剂(MGD)，HuR可促进肿瘤生长、侵袭及治疗抵抗。dHuR结合CRBN(Cereblon)E3连接酶，通过其苯并呋喃连接的复合表面招募HuR作为新底物，与其β‑发夹G‑loop降解子(degron)相互作用，三元复合物结构经冷冻电镜(cryo‑EM)解析。dHuR通过诱导BRAF pre‑mRNA第18外显子跳跃(exon 18 skipping)降低BRAF蛋白表达，对BRAF突变型CRC(包括获得性BRAF抑制剂耐药株)具有强效抑瘤作用。研究人员进一步通过激酶组CRISPR文库筛选发现，EGFR或MEK失活可增强dHuR的细胞毒性，据此提出联合抑制策略用于治疗难治性BRAF突变型CRC。
《Nature》研究解读：靶向HuR的分子胶降解剂dHuR通过诱导BRAF外显子跳跃抑制BRAF突变型结直肠癌
研究背景与立题依据
约10%的结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)携带BRAF功能获得性突变，以BRAFV600E最常见，该类患者预后极差。不同于BRAF突变型黑色素瘤对BRAF抑制剂(BRAFi，如Vemurafenib、Encorafenib)敏感，BRAF突变型CRC存在EGFR反馈活化导致的MAPK通路再激活，使单药BRAFi无效；FDA批准的BRAFi＋抗EGFR抗体(Cetuximab)方案客观缓解率仅20%–26%，且多数患者在4–6个月内复发，超过75%患者缺乏持久治疗选择。RNA结合蛋白HuR(人抗原R，由ELAVL1基因编码)在多种肿瘤中高表达并促进癌基因(VEGF、Cyclin D1等)mRNA稳定性及翻译，被认为是有前景但"难成药(undruggable)"的靶点——既往HuR小分子抑制剂因活性低或递送困难均未进入临床。分子胶降解剂(Molecular Glue Degrader, MGD)可诱导E3连接酶与新底物形成三元复合物，驱动靶蛋白泛素化降解，其中CRBN(Cereblon，CRL4CRBNE3连接酶底物受体)类分子胶已成功降解IKZF1/3、GSPT1等蛋白，但尚无MGD靶向HuR的报道。本研究旨在开发CRBN依赖的HuR降解剂，并探究其在BRAF突变型CRC中的治疗价值及分子机制。
主要关键技术方法
研究人员设计并合成含万余种化合物的CRBN类分子胶化合物库，通过均相时间分辨荧光(HTRF)法初筛CRBN结合力；以CRBN野生型(WT)与CRBN敲除(KO)细胞经化合物池处理后进行串联质谱标签(TMT)定量蛋白质组学筛选HuR降解候选物；通过环己酰亚胺(CHX)追踪、蛋白酶体抑制剂(MG132)及NEDD8活化酶抑制剂(MLN4924)验证降解的CRBN依赖性与蛋白酶体途径；利用NanoBRET、时间分辨荧光共振能量转移(TR‑FRET)、表面等离子共振(SPR)及体外泛素化重建实验表征CRBN–dHuR–HuR三元复合物形成及HuR多聚泛素化；解析DDB1–CRBN–dHuR‑2–HuR(RRM1‑RRM2结构域)三元复合物的冷冻电镜(cryo‑EM)结构(分辨率3.3 Å)；通过DepMap数据库分析HuR与BRAF共依赖性；以BRAF突变型及野生型CRC细胞系、CRBN‑KO、HURG58A(降解抵抗突变)及HUR‑KO细胞为模型，检测细胞活力(CCK‑8/MTS)、3D类器官成球、裸鼠Colo205异种移植瘤及BRAFV600E患者来源异种移植瘤(PDX)药效；采用RNA‑seq分析差异剪接(关注BRAF exon 18 skipping)、KEGG富集；通过RNA免疫沉淀(RIP)、RNA pull‑down、体外SPR测定HuR与BRAF intron 17 U‑rich元件(URE)的直接结合；构建BRAF异构体(X1含exon 18，X2缺exon 18)及minigene报告系统验证剪接调控；建立实验室诱导BRAFi耐药细胞系及全激酶组CRISPR筛选鉴定dHuR‑2合成致死基因。
研究结果
dHuRs identified by proteomics（蛋白质组学鉴定dHuR分子胶降解剂）
研究人员以CRBN‑WT与CRBN‑KO细胞经化合物库混合处理进行全局定量蛋白质组学，发现HuR在CRBN‑WT中特异性下调，从中分离出先导化合物dHuR‑1，可在细胞中剂量/时间依赖性降解HuR，该降解可被MG132或MLN4924阻断，且CHX追踪显示HuR半衰期缩短依赖CRBN存在，证实其为CRBN依赖的蛋白酶体降解。构效关系研究表明dHuR‑1独有的苯并呋喃(benzofuran)母核对HuR结合至关重要，替换为其IMiD(免疫调节药物)骨架则丧失降解活性；优化后获得dHuR‑2(DC50=3.8 nM，Dmax=96%)，蛋白质组学显示其选择性降解HuR及已知CRBN新底物ZFP91、ZMYM2，不降解GSPT1及HuB/C/D等同源蛋白。
Characterization of the CRBN–MGD–HuR complex（CRBN–MGD–HuR三元复合物的结构表征）
HuR的RRM1域G‑loop中G58(而非G144)是dHuR介导降解的关键degron残基，严格需甘氨酸；CRBN的E377与V388为结合HuR所必需(人源CRBN E377/V388对应小鼠Crbn E380/V391，小鼠Crbn I391V/V380E双敲入后方能为人源dHuR所降解)。SPR与TR‑FRET证明dHuR‑2比dHuR‑1更强促进CRBN–DDB1与HuR结合形成三元复合物；体外E1/E2/E3重组系统证实dHuR‑2驱动CRL4CRBN介导HuR多聚泛素化。解析的cryo‑EM结构显示：dHuR‑2谷氨酰亚胺环结合CRBN Tri‑W口袋(W380/W386/W400)并与H378形成氢键；苯并呋喃部分与CRBN W386/H378/P352堆积；吡唑指向HuR G58环；HuR R53与CRBN E377形成盐桥；dHuR‑2诱导CRBN与HuR间额外约780 Å2埋藏表面积，稳定三元复合物。
HuR degradation inhibits BRAF‑mutant CRC（HuR降解抑制BRAF突变型CRC）
DepMap分析显示BRAF突变是最强预测HuR依赖性的基因变异，BRAF突变型CRC细胞系对dHuR‑2增殖抑制显著敏感(6/6株IC50低)，BRAF野生型CRC即使发生HuR降解也不敏感。CRISPR‑Cas9敲除HUR或使用降解抵抗HURG58A细胞及CRBN‑KO细胞均取消dHuR‑2的抗增殖作用，证实表型依赖HuR降解。Colo205异种移植瘤中口服dHuR‑2(6.25–25 mg/kg，bid，28天)呈剂量依赖性抑瘤，耐受良好，瘤内HuR降解证实靶标结合。RNA‑seq与KEGG显示dHuR‑2下调MAPK信号与细胞周期通路；dHuR‑2(非HURG58A细胞)降低磷酸化ERK(p‑ERK)、BRAF及EGFR蛋白水平，诱导G1期阻滞——表明HuR降解通过下调BRAF/EGFR抑制MAPK通路。
HuR regulates BRAF alternative splicing（HuR调控BRAF可变剪接）
dHuR‑2不降低BRAF总mRNA量但减少新生BRAF蛋白合成；RNA‑seq与RT‑PCR显示dHuR‑2促进BRAF pre‑mRNA第18外显子跳跃(exon 18 skipping)，生成截短转录本BRAF‑X2(缺失154 bp致移码)，该现象在HUR‑KO及HURG58A细胞中消失。RIP与RNA pull‑down结合ENCODE eCLIP‑seq数据定位HuR直接结合BRAF intron 17中U‑rich元件(URE)；SPR测得HuR与URE高亲和力；minigene实验中URE缺失或U→C突变消除dHuR‑2诱导的外显子跳跃，且该调控具人特异性(小鼠Braf intron 17无保守URE)。过表达无内含子BRAFV600ECDS可回救dHuR‑2增殖抑制，含intron 17的BRAFV600E则不能——证实BRAF外显子18跳跃是dHuR抗增殖的主要机制。BRAF‑X2蛋白表达极低且无法活化ERK，多核糖体分析显示其翻译效率显著低于含exon 18的BRAF‑X1。此外HuR降解亦降低VEGFA mRNA(结合并稳定VEGFA intron 5 URE调控其剪接)及分泌VEGFA，体内Colo205移植瘤微血管密度(CD31+)下降。
dHuRs inhibit BRAFi‑resistant cells and synergize with BRAFi（dHuR抑制BRAFi耐药细胞并与BRAFi协同）
长期诱导的BRAFi(Encorafenib/Dabrafenib)耐药BRAFV600E/KCRC及黑色素瘤细胞对dHuR‑2仍敏感(保留HuR或BRAF敲除敏感性)，耐药株特征为EGFR/FGFR/MET及RAS上调及p‑EGFR反馈再活化，而dHuR‑2持续抑制p‑ERK并下调BRAF/EGFR。dHuR‑2与亚阈值BRAFi在BRAF突变CRC细胞及BRAFV600EPDX模型中显示协同抑瘤及更强MAPK通路抑制。全激酶组CRISPR筛选发现EGFR或MAP2K1(MEK1)敲除增强dHuR‑2细胞毒性；EGFR抑制剂(Gefitinib)或MEK抑制剂(MEK162)与dHuR‑2联用在多株BRAF突变CRC中具有叠加/协同克隆形成抑制。
讨论(Dsicussion)部分总结翻译
BRAF突变型CRC临床预后差，现有BRAFi联合方案耐药率高。本研究鉴定HuR为BRAF突变型CRC的脆弱性靶点，报道首例CRBN类HuR分子胶降解剂dHuR‑1/dHuR‑2；证实HuR降解通过诱导BRAF exon 18 skipping降低致癌BRAF蛋白、下调EGFR及VEGFA(抑制血管生成)，克服BRAFi耐药；CRBN–dHuR‑2–HuR三元复合物cryo‑EM结构阐明分子胶重塑E3界面招募新底物的结构基础。局限性在于耐药模型为实验室诱导，未来需在临床耐药样本中验证。同期其他研究报道基于RNF165或PROTAC的HuR降解剂但未进入临床前评价；本研究dHuR为单价经典分子胶，已在临床前显示良好PK/PD与安全性。Degron Therapeutics基于该发现开发的临床候选分子DEG6498(HuR MGD)已获监管机构批准进入晚期实体瘤(含BRAF突变CRC扩展队列)Ⅰ期临床试验(ClinicalTrials.gov NCT07244835)，支持HuR降解策略的临床转化潜力。
