在雌性整个生殖寿命期间，卵巢经历数百次卵泡发育、排卵和组织再生周期。衰老如何破坏如此精确的多细胞相互作用在时间和空间上的协调，目前尚不清楚。研究人员利用Slide-seq（一种近细胞分辨率的空间转录组学方法），对22个小鼠卵巢在生殖周期和 chronological ages 期间的样本进行了分析，在69个空间图谱中捕获了610,620个位点。研究人员开发了一种新的分割流程，以检验358个卵母细胞、668个卵泡和236个黄体的多细胞动力学，发现衰老即使在生殖周期停止之前就损害了卵泡发生所需的空间和时间协调。这些破坏以免疫细胞动力学改变、炎症信号传导和全局性组织紊乱为特征，损害了卵巢功 能所需的周期性重塑。研究人员的发现揭示了多细胞微环境如何协调卵巢功能，并证明与年龄相关的组织结构破坏先于生育能力的终结。
卵巢是一种高度动态的器官，在整个生殖周期中通过表型转换来协调卵母细胞成熟、排卵和内分泌信号传导。这种"稳态循环"在小鼠中约发生150-650次，在人类女性中约发生300-400次。时序性衰老导致生殖功能进行性下降，最终导致这些循环的终止。卵巢功能的中心是卵泡，卵泡是多细胞结构，负责发育生长中的卵母细胞，并在排卵后转化为黄体（corpus luteum, CL）。卵泡发生从原始卵泡开始，原始卵泡由休眠的卵母细胞和被扁平的颗粒细胞（granulosa cells, GCs）包裹组成。卵泡激活触发GC增殖，首先形成窦前卵泡，后者经历形态和功能变化以支持卵母细胞生长，然后过渡到促性腺激素依赖性的、具有类固醇生成作用的窦状阶段。值得注意的是，招募的卵泡中不到1%能达到排卵，其余则发生闭锁（即受控的卵泡死亡）。排卵后，卵泡残留物转化为黄体，黄体是一种产生孕激素的临时内分泌结构，对妊娠和周期调节至关重要。卵泡成熟跨越多个生殖周期，在小鼠中约18天，在人类中约375天，创造了一个极其复杂的组织环境，其中数十个（小鼠）或数千个（人类）处于不同发育阶段的卵泡与多个黄体共享同一物理空间。
先前的卵巢衰老研究主要集中在卵泡耗竭和卵母细胞内在变化，如非整倍性。然而，越来越多的证据表明，整个卵巢组织环境的功能障碍也显著促进生殖衰退。已知的破坏包括GC信号传导异常、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑异常和免疫细胞异常浸润，但这些事件如何 collectively 驱动卵巢衰老仍不清楚。虽然单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）是揭示细胞异质性及其调控机制的强大工具，但其在卵巢研究中的应用受到限制。基于液滴的scRNA-seq方法通常无法捕获直径可超过70 μm的成熟卵母细胞，导致对早期卵母细胞的偏倚。此外，scRNA-seq会解离相互作用的细胞类型，从而丢失卵泡微环境的空间背景，而粗放的空间转录组学又缺乏表征卵泡结构所需的分辨率。
研究人员利用Slide-seq技术，对自然循环的C57BL/6J小鼠卵巢进行了时空图谱绘制，跨越了生殖衰老过程。研究人员从22个生物学样本中生成了69个空间转录组图谱，在发情期（estrus）和后发情期（metestrus）以10 μm分辨率捕获了610,620个位点。为分析多细胞卵巢结构的协作性质，研究人员开发了一种分割流程，识别了358个原始和生长中的卵母细胞、668个卵泡（其中301个包裹卵母细胞）和236个黄体，从而能够对其原位分子特征进行高分辨率分析。
**空间转录组学揭示循环和衰老卵巢的多细胞组织**
研究人员从小鼠三个生殖年龄组生成空间转录组图谱：年轻组（10-12周）、中年组（36-40周）和老年组（52-54周）。无监督聚类和事后注释解析了所有主要卵巢细胞群，包括卵母细胞（Gdf9）、多个GC亚型、膜细胞（theca cells, Col1a2）和两个不同的黄体群体（Parm1或Akr1c18）。研究人员还鉴定了上皮细胞（Epcam）、成纤维细胞（Pdgfra）、平滑肌细胞（Tagln）、免疫细胞（Lyz2）、内皮细胞（Flt1）和基质细胞（Aldh1a1）。为验证这些Slide-seq注释，研究人员还进行了全卵巢单核RNA测序（single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq）。虽然snRNA-seq恢复了一致的细胞类型集合，但显示出显著的卵母细胞和卵丘细胞丢失，突显了空间分析在捕获更全面的卵巢细胞图谱方面的优势。
研究人员开发的分割流程将解剖和功能相关的空间位点分组，即卵母细胞、卵泡和黄体。该方法识别了卵泡发生不同阶段的卵泡片段，包括窦前（n=238）、窦状有丝分裂（n=191）、窦状黄体化（n=43）和闭锁（n=181）卵泡，以及两种空间分离的黄体类型：Parm1
+黄体（n=87）和Akr1c18
+黄体（n=147）。所有分割结果通过相邻H&E染色切片的手动注释进行了验证。此外，研究人员通过检查卵泡内免疫细胞的空间分布，为闭锁卵泡提供了超出转录组特征的正交验证：闭锁卵泡表现出显著的向卵泡中心免疫浸润，与清除一致，而健康卵泡的免疫存在极少。
**卵母细胞在卵泡发育过程中遵循协调的转录程序**
虽然卵母细胞传统上被视为母源RNA的转录沉默储存单位，但近期证据揭示了其在整个成熟过程中的活跃转录调控。研究人员的原位分析显示，典型卵母细胞标志基因在其卵泡阶段呈差异性表达。通过非负矩阵分解（non-negative matrix factorization, NMF）揭示了卵母细胞成熟过程中五个不同的基因程序：程序2以透明带糖蛋白基因Zp2和Zp3为特征，在原始和窦前卵母细胞中上调，提示卵泡组装所需成分的合成；程序4富含Bmp15和F-box蛋白基因（Fbxw19、Fbxw21、Fbxw24），编码控制细胞周期进程的SCF泛素E3连接酶复合物组分，在成熟窦状卵母细胞中出现，反映了减数分裂进程所需的转变；程序0（Bcl2l10、Btg4、Tcl1）在成熟卵母细胞中显著增加，标志着对促性腺激素 surge 反应的生长准备。值得注意的是，闭锁卵母细胞未能维持这些程序的表达，表现出Padi6表达的丧失和卵母细胞程序0的过早诱导。
**衰老改变卵母细胞成熟调控因子**
衰老导致卵母细胞数量减少和功能下降。与之一致，研究人员观察到所有卵泡阶段的卵母细胞数量随年龄急剧下降。年轻和老年动物成熟卵母细胞之间的差异表达分析显示转录改变，包括核雄激素受体（androgen receptor, Ar）编码基因和孕激素代谢酶（Akr1c18）编码基因的上调。鉴于它们在卵母细胞成熟和减数分裂中的作用，其增加可能反映了对衰老卵巢改变内分泌环境的适应性转变。相反，研究人员观察到胰岛素降解酶基因Ide表达的降低。由于Ide调节胰岛素信号以维持卵母细胞质量，其在健康卵泡发生过程中减弱胰岛素信号传导，其下调提示代谢稳态的破坏。研究人员还检测到Nlrp9b家族基因（Nlrp9a/b/c）的下调，这些是亚皮质母源复合物的组分，被认为促进卵母细胞-胚胎转变。重要的是，这些趋势在不同卵泡类型的卵母细胞中一致，表明这些变化反映卵母细胞内在变化而非随年龄变化的卵泡组成转变。
**分子程序定义年轻卵巢中空间组织的卵泡生命周期**
为研究GC状态在整个卵泡发生过程中的变化，研究人员设计了一种从卵泡中心归一化、缩放的径向距离，以比较数百个不同大小卵泡的GC组织。沿此径向轴量化GC组成揭示了广泛的卵泡内异质性，表明卵泡阶段之间的转变不是由同步的卵泡全范围切换驱动，而是可能通过细胞-细胞相互作用变化的局部传播而出现。分析表明GC在卵泡内维持空间分化的分工，平衡生长和分化：增殖的、未成熟的GC在卵泡中心富集，而成熟的Cyp19a1
+ GC具有更高的扩散伪时间（diffusion pseudotime, DPT），定位于外周。GC基因表达程序（gene expression programs, GEPs）分析揭示了内部和外部位置之间的功能分区：FSH响应程序（GEP2；Inhbb、Fst）在中央富集，而类固醇生成程序（GEP1；Hsd3b1、Lhcgr、Mro）定位于外周，这与靠近膜-颗粒边界的接近程度影响GC特化的先前观察一致。这种径向组织在闭锁卵泡中丧失，表现出两种程序的全局性减少。
**衰老破坏GC分化的时序轨迹并改变闭锁进展**
年轻卵巢中，GC轨迹定义的GEP使用遵循有序进展：窦前卵泡中的GC启动早期发育程序（GEP9；Wt1、Wnt4），在窦状期通过增殖扩张（GEP3；Top2a、Mki67），随后诱导卵泡优势化（GEP2和GEP4；Inhbb、Fst；Esr2、Greb1l）和黄体化（GEP1；Lhcgr、Hsd3b1）程序，在后发情期达到高峰。闭锁卵泡以凋亡相关程序（GEP10和GEP11；Thbs1、Pik3ip1；Ghr、Ptprd）为特征。相比之下，老年卵巢显示出GEP的时间和强度改变，表明卵泡发育过程中GC状态转变的正常序列发生破坏。例如，衰老的窦状卵泡下调黄体化程序（GEP1）。值得注意的是，闭锁卵泡受衰老影响最大，经典凋亡相关程序（GEP10和GEP11）减少，而ECM重塑程序（GEP6；Col1a2、Lama2）异常上调，该程序在年轻卵巢中通常为窦前卵泡特异性。这些模式表明年龄相关的从受调控到失控的卵泡微环境重塑转变，导致发育和退化过程边界之间的"分子模糊"。
研究人员进一步详细表征了闭锁GC的异质性，鉴定了三种不同的闭锁GC状态：状态1反映代谢重编程（Cdk8、Hexb、Hsd3b1、Tpt1）；状态2反映氧化应激反应和基质重塑（Clu、Gpx3、Sparc、Col1a2）；状态3反映凋亡和免疫调节特征（Foxo1、Ghr、Pik3ip1、Cfh、Cd47）。基于分区图抽象（partition-based graph abstraction, PAGA）和伪时间分析的轨迹推断支持从状态1到状态3的渐进转变，终末状态3在后发情期富集。闭锁似乎起源于多个非闭锁GC群体，特别是来自早期窦状卵泡，与优势卵泡选择前发生的高卵泡丢失率一致。衰老与终末闭锁状态3频率在卵泡阶段中的降低相关，提示向终末闭锁的进展受损。这一转变伴随补体基因的上调和吞噬抑制性"别吃我"信号Cd47表达的降低，提示成功的闭锁需要协调进入凋亡、免疫活跃状态以进行卵泡清除，而衰老损害这一过程，可能促进未解决的闭锁和卵泡碎片的积累。
**多细胞动力学和相互作用塑造卵泡发生进展**
卵泡发生由多种细胞类型之间的协调相互作用驱动，超越了细胞内在的颗粒程序。为解析这种高阶组织，研究人员沿计算推断的卵泡发生轨迹排序了来自生殖年轻小鼠的卵泡片段，使用扩散伪时间重现了从窦前到窦状或闭锁卵泡的经典转变。为将这些组成变化与细胞间信号传导联系起来，研究人员应用MultiNicheNet推断卵母细胞、颗粒、膜和免疫细胞之间的受体-配体相互作用。该分析揭示了卵泡阶段特异性通讯模式，包括窦前卵泡中卵母细胞与GC之间的Gdf9-Fxyd6、窦状卵泡中颗粒与膜细胞之间的Fst-Bmpr1b，以及闭锁卵泡中GC内的Apoa4-Lrp1。闭锁富集的Apoa4-Lrp1相互作用涉及卵泡退化期间的代谢重编程：Lrp1调节脂质运输和葡萄糖代谢，而Apoa4促进脂质处理并促进葡萄糖摄取。
**衰老破坏卵泡激活、成熟和激素感应的时间耦合**
卵巢衰老的一个标志是不规则循环的出现，表明内分泌信号和卵巢功能的时序调节受损，如人类围绝经期所观察到的。虽然本研究中的老年小鼠被确认仍在循环，但其分子图谱显示了与年轻卵巢中发情周期和卵巢细胞状态之间紧密耦合的时间协调性的丧失。在年轻小鼠中，卵泡状态与其周期阶段紧密耦合：与后发情期相比，发情期的特征为窦前卵泡更丰富、窦状有丝分裂卵泡更小、卵泡表现出更早的伪时间（表明不太成熟的卵泡状态分布），以及窦状卵泡中促性腺激素受体Lhcgr和Fshr表达降低，反映了其从促性腺激素非依赖性窦前状态的近期转变。相比之下，老年小鼠在发情期和后发情期之间缺乏这些阶段依赖性模式：窦前卵泡频率和窦状卵泡大小没有变化，投射到年轻参考轨迹上的老年卵泡未显示DPT分离，窦状卵泡中Fshr和Lhcgr表达在发情期和后发情期之间也没有差异。总之，年轻卵巢中促性腺激素同步卵泡群以协调向排卵或闭锁的进展，而老年卵巢中卵泡在发情期更大、更成熟，表明发育时序被破坏，卵泡发生的时间调节与发情周期脱钩。
**衰老时CL清除失调可能引发炎症重塑**
研究人员接下来检查了排卵后黄体细胞的动态是否也随年龄改变。两种空间分离的黄体细胞群体具有相反的孕激素调控程序，提示黄体生命周期中的时间表型转换。Parm1富集的黄体（"CL – Parm1"）表达孕激素合成基因，含有血管内皮细胞，在发情期富集，由组织学上较小的细胞组成，特征与新形成的、激素活跃的黄体一致。相比之下，Akr1c18富集的黄体（"CL – Akr1c18"）表达黄体退化标志物Ptgfr，被免疫细胞浸润，在后发情期更频繁，含有组织学上较大的细胞，特征与黄体溶解和退化一致。
在衰老卵巢中，虽然黄体亚型之间的这些转录差异得以保留，但Akr1c18黄体在发情期与年轻卵巢相比显著积累，提示未能及时清除。由于及时的黄体退化和伴随的孕激素下降是启动下一个周期所必需的，这些退化黄体的持续存在可能破坏孕激素稳态，可能损害周期进展。持续黄体表现出黄体溶解和炎症信号传导的失调：年轻卵巢中，免疫细胞在发情期积累于退行性Akr1c18黄体内以促进组织清除；然而，在衰老卵巢中，该区域的免疫细胞浸润反而转移到后发情期，提示时机不当或持续的炎症招募。衰老Akr1c18黄体也未能在后发情期诱导关键催乳素和前列腺素响应的黄体溶解基因（Prlr、Ptgfr），反而上调炎症趋化因子Ccl2、Il1b和Ccl3。这些观察提示Akr1c18黄体的缺陷性退化可能是卵巢炎性衰老（inflammaging）的焦点促成因素。全局而言，在所有卵巢区域中，与年龄相关的免疫扩张在黄体中最为明显。总之，衰老破坏及时的黄体清除，产生持续的炎症微环境，导致功能失调的内分泌时钟，并可能引发衰老卵巢中更广泛的病理性免疫重塑。
**空间免疫重塑揭示卵巢炎性衰老的多种驱动因素**
为确定衰老如何重塑全局免疫组织，研究人员表征了卵巢中免疫群体的组成和空间结构。首先鉴定了关键免疫亚群，包括四个巨噬细胞亚群（吞噬性、抗原呈递、胞葬性和代谢活跃性）、树突状细胞、肥大细胞、浆细胞和T细胞，每个群体占据不同的空间微环境。吞噬性和抗原呈递巨噬细胞（巨噬细胞1和2）是主要群体，并随年龄优先在窦前和闭锁卵泡以及黄体中扩张。在所有年龄中，吞噬性巨噬细胞定位于卵泡和黄体的外周，而抗原呈递巨噬细胞集中于卵泡和黄体中心，这种分区在衰老卵巢中更为显著。虽然数量较少，但T细胞在衰老黄体中的扩张可能代表了先前报道的衰老小鼠卵巢中细胞毒性和双阴性T细胞积累的解剖位置。
**多核 giant cells 定义衰老卵巢中的特殊巨噬细胞融合病理**
在年龄扩张的免疫微环境中，多核 giant cells（multinucleated giant cells, MNGCs）作为一种独特的巨噬细胞相关病理出现。MNGCs的积累是与卵巢衰老相关的慢性炎症和纤维化的标志，在H&E切片上可见为融合的细胞簇。通过将相邻H&E切片注册到Slide-seq位点，比较MNGC内外的免疫位点，揭示了MNGC内吞噬性巨噬细胞的富集。MNGC内的巨噬细胞采用了与周围基质不同的专门化转录程序：抗原呈递巨噬细胞表达补体和融合相关基因（Tagln、Acta2、Itgae），胞葬性巨噬细胞表达清除程序（Gpnmb、Mfge8、Ctsd），代谢活跃巨噬细胞表达炎症-脂质重塑特征（Pla2g7、Lyz2、Lgals3）。这些发现提示MNGC代表潜在连接免疫功能障碍与纤维化病理的专门化炎症融合微环境。
**衰老破坏卵泡间空间耦合**
与年龄相关的免疫重塑与更广泛的不成组织紊乱趋同，提示炎性衰老的器官水平后果。研究人员观察到表面上皮和免疫细胞群体的进行性扩张，伴随类固醇生成基质细胞的耗竭。上皮增厚通过相邻H&E切片的形态测量学独立确认。细胞类型组成变化伴随转录变化，表现为ECM基因表达降低和金属蛋白酶增加（可能提示异常ECM重塑），以及纤维化特征和炎症特征升高。
研究人员进一步探究基质重塑是否改变衰老过程中卵泡发育的空间协调。通过量化同型卵泡（即相同发育阶段的卵泡）之间的空间共定位，发现在短空间尺度（<500 μm）上，窦前和闭锁卵泡在年轻但非衰老卵巢中高度共定位。这与先前证据一致，即窦前卵泡之间的空间耦合促进其激活和早期发育，而窦前簇的丧失可能部分反映ECM rigid 性的增加。年轻卵巢中闭锁卵泡的共定位进一步提示卵泡选择期间的空间协调旁分泌信号，可能由优势卵泡发出的信号塑造。相比之下，窦状卵泡在年轻或老年小鼠中均未显示短程共定位，与其在优势卵泡选择期间作为孤立"岛屿"的相对空间隔离一致。总之，衰老破坏卵泡聚集和空间协调，可能损害卵泡间通讯。这些发现支持一个模型，其中免疫重塑、ECM硬化和卵泡空间组织丧失代表卵巢衰老的相互关联层面，从细胞水平功能障碍到微环境破坏再到组织水平紊乱。
**讨论**
本研究呈现了衰老过程中自然循环小鼠卵巢的近细胞分辨率空间转录组学图谱，揭示了卵巢衰老以多尺度时空组织结构的进行性侵蚀为特征。跨越细胞、微环境和组织尺度，衰老破坏了卵泡内的空间模式、卵泡发生和黄体周转的时间协调，以及免疫-基质稳态，这些变化在循环停止之前就已出现。这些发现表明，生殖衰老可被视为组织水平协调的进行性破坏，而非仅仅卵泡储备的耗竭。
研究人员的发现提示卵泡的空间组织是生存和资源分配的优雅机制。通过将增殖活动区室化于内层GC，将激素感应和类固醇生成功能区室化于靠近血管和基质的外层GC，卵泡在这种竞争环境的能量约束下优化资源分配。研究人员假设，卵泡发生期间GC功能的成功空间区室化可能有助于卵泡命运，优势卵泡有效维持功能极性，而效率较低的竞争者则发生闭锁。更广泛而言，研究人员的发现精炼了将卵泡闭锁视为与代谢、免疫和组织重塑程序相关的异质性过程的观点，而非统一的退化终点。
成功的生殖循环依赖于局部组织动力学与全身内分泌信号之间的精确时间协调。年轻小鼠中，组织范围的重塑过程与发情周期紧密耦合，确保卵泡动态、闭锁和黄体退化的同步进展。然而，随着年龄增长，这种同步性恶化：卵泡失去阶段和卵泡类型限制的发育和闭锁程序的调控，黄体跨阶段持续存在。这些特征与人类围绝经期观察到的黄体期改变平行，支持生殖衰老表现为局部组织动力学与全身激素节律进行性脱钩的模型。
这些发现对理解和缓解人类生殖衰老具有重要意义，后者仍难以在高等时间分辨率下进行大规模研究。空间和 时间协调在周期停止之前就已崩溃的观察，提示了年龄相关性生育力下降早期检测和干预的潜在机会。此外，组织范围组织在维持卵巢功能中的重要性，意味着有效的治疗策略可能需要靶向整个卵巢环境，而非仅仅专注于卵母细胞或单个卵泡。
研究结果还突出了几个未解决的问题：GC功能的空间区室化如何在高度增殖背景下建立和维持；卵泡微环境中改善的分工是否会改变闭锁；邻近卵泡如何协调发育状态；以及退化的卵泡和黄体细胞如何被有效清除。解决这些问题需要结合扰动方法和卵泡命运追踪方法。最重要的是，靶向细胞周转或炎症通路的干预是否能在衰老过程中保留卵巢功能，仍有待观察。更广泛而言，确定细胞周转、免疫活性和组织重塑如何协调，可能揭示超出卵巢的、适用于衰老和再生系统组织维持的普遍原则。
总之，研究人员的发现提示卵巢衰老反映了卵泡发育、内分泌信号传导和组织重塑方面协调的时空结构的进行性失败。在这一模型中，细胞组织和组织清除的局部缺陷跨越微环境传播，产生器官水平的紊乱。更广泛而言，这些结果将衰老框定为协调的组织动力学的破坏，为理解生殖衰退提供了概念基础，并为保留生育力和卵巢内分泌功能开辟了新途径。
