失调的细胞内脂质代谢是心力衰竭（Heart Failure, HF）的驱动因素之一，而HF最常见的病因是扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy, DCM）。然而，缺陷性脂质信号如何在分子水平破坏衰竭心肌细胞（Cardiomyocytes, CMs）的稳定性尚不清楚。研究人员利用人诱导多能干细胞来源心肌细胞（induced pluripotent stem cell–derived cardiomyocytes, iPSC-CMs）、患者源性心脏组织及活体成年CMs，阐明DCM和HF中脂质依赖性的内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）功能紊乱，并识别新的治疗靶点。脂类组学（Lipidomics）揭示携带致DCM肌小节蛋白突变（原肌球蛋白tropomyosin；肌钙蛋白T troponin T）的iPSC-CMs中存在异常细胞内胆固醇。CMs中胆固醇升高与异常ER形态及功能障碍相关联。受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion, STED）显微镜、电子断层扫描（electron tomography）及生化分析表明，病理性ER重塑及异常曲率由DCM CMs中肌小节错位导致肌小节/细胞骨架与ER接触位点丧失所触发。机制上，该信号轴通过肌小节–ER接触位点双向调控ER膜功能障碍和异常胆固醇水平。恢复细胞内胆固醇平衡可挽救DCM iPSC-CMs中的ER膜重塑、肌小节–ER接触位点信号传导及肌小节排列紊乱，最终改善DCM iPSC-CMs的缺陷收缩功能——这是含错位、功能失调肌小节细胞骨架的衰竭CMs的关键特征。研究人员在终末期DCM心脏及活体心房心肌细胞中验证了该发病机制。研究结果表明，细胞内胆固醇作为保守的ER膜调节因子和结构决定因子在人CMs中发挥作用。综上，研究人员呈现了DCM的脂类组学图谱，并确定缺陷性ER/胆固醇信号传导是疾病驱动因素，其治疗靶向可挽救衰竭CMs的关键功能。
研究背景与目的
扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy, DCM）是致青年人心力衰竭（Heart Failure, HF）及心脏移植最常见的原因，以左心室扩张、收缩功能受损为特征，现有治疗手段仍有局限。近年证据表明终末期DCM存在脂质失衡，但特定脂质如胆固醇在心肌细胞（Cardiomyocyte, CM）内代谢紊乱如何影响DCM/HF中心肌细胞代谢及收缩功能尚不明确。胆固醇对内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）——脂质合成枢纽——及心肌细胞中特化的肌浆网（Sarcoplasmic Reticulum, SR）膜组织至关重要。本研究旨在探究胆固醇如何调控CMs中ER依赖的细胞内稳态，及其在DCM/HF病理性CM功能不全中的作用。
研究人员采用患者特异性及CRISPR/Cas9编辑的iPSC-CM模型（携带肌小节蛋白突变：troponin T TnT-R173W/TnT-R141W、tropomyosin TPM1-L185F）、终末期DCM患者左心室组织及冠状动脉旁路移植术获取的人活体心房CMs，结合超高分辨率成像、脂类组学、生化与功能学检测，揭示了一条由肌小节蛋白DCM突变引发的新病理通路：肌小节错位→肌小节–ER接触位点丢失→ER结构崩解、膜曲率丧失、ER形态发生蛋白相对减少→细胞内胆固醇蓄积→加重收缩功能障碍；并证明通过基因矫正或降胆固醇药物（pitavastatin、squalene synthase抑制剂TAK475）恢复细胞内胆固醇平衡可挽救ER架构与收缩功能。该发现提示细胞内胆固醇调控可作为伴肌小节突变的DCM-HF亚群潜在治疗方向。论文发表于Signal Transduction and Targeted Therapy 。
主要关键技术方法
研究人员使用以下核心方法开展研究：(1) 患者来源及CRISPR/Cas9基因编辑（引入TPM1-L185F、TnT-R141W突变及修正TPM1-L185F突变）的人iPSC分化为跳动心肌细胞(iPSC-CMs)；(2) 纳米液相色谱串联质谱脂类组学(Lipidomics)分析iPSC-CMs及终末期DCM患者左心室组织脂质谱；(3) perfringolysin O D4结构域(GFP-D4)胆固醇生物传感器检测质膜胆固醇；(4) 共聚焦及受激发射损耗显微镜(STED)观察ER标记蛋白Sec61β/KDEL分布，透射电镜(TEM)及冷冻电镜断层扫描(cryo-ET)评估ER–肌小节互作距离与ER膜曲率；(5) 免疫共沉淀(Co-IP)检测ER跨膜蛋白CKAP4与肌小节蛋白(MYH7、α-actinin/SAA、TPM1、TnT)相互作用；(6) IonOptix系统检测iPSC-CMs收缩功能；(7) 终末期DCM患者左心室组织及接受CABG患者分离的原代成人心房CMs进行ER染色与Western blot验证。
研究结果
Dysregulated lipid homeostasis is a hallmark of iPSC-derived cardiomyocytes from DCM patients harboring sarcomeric protein mutations（DCM患者肌小节蛋白突变iPSC-CMs中失调的脂质稳态是标志性特征）
脂类组学显示DCM(PAT/MUT) iPSC-CMs相较WT对照多种脂质失衡，胆固醇、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂等显著升高；GFP-D4胆固醇探针证实质膜胆固醇在DCM iPSC-CMs中升高。胆固醇合成关键酶HMGCR、LSS、FDFT1及ACAT1总蛋白量未升甚至略降，磷酸化HMGCR无差异，说明胆固醇蓄积非合成酶上调所致。CRISPR/Cas9修正TPM1-L185F突变(PAT1-COR)可使胆固醇及酶水平趋向WT。
Sarcomere protein mutations cause disrupted ER network architecture in iPSC-derived cardiomyocytes from DCM patients（肌小节蛋白突变致DCM患者iPSC-CMs中ER网络结构破坏）
Sec61β免疫荧光显示DCM iPSC-CMs胞质ER网络面积显著缩小、ER向核周凝聚，ER连接点、分支数、分支长度及总长度均减少；STED超分辨成像确认ER区室分布异常。SR(SERCA2标记)面积无差异，SR与ER(KDEL或REEP5标记)共定位低，说明主要是ER而非SR结构异常。
The ER architecture of DCM (MUT) iPSC-CMs is dysfunctional due to loss of membrane curvature（DCM MUT iPSC-CMs的ER架构因膜曲率丧失而功能异常）
cryo-ET三维重构显示DCM(MUT1) iPSC-CMs中ER膜平均曲率显著降低。ER塑形蛋白REEP5、RTN4、ATL3、LNP、KTN1总蛋白量在DCM中降低，但归一化至相对ER阳性面积后无差异或升高，提示ER塑形蛋白绝对量减少源于ER整体萎缩而非原发性表达下调，肌小节DCM突变是ER膜架构异常的structural causative 原因。
DCM mutations impair sarcomere–ER interactions, leading to loss of ER organization in iPSC-CMs（DCM突变损害肌小节–ER互作致iPSC-CMs中ER组织丢失）
α-actinin(ACTN2)/TPM1染色示DCM iPSC-CMs肌小节排列紊乱，CRISPR修正后改善。Co-IP显示ER驻留蛋白CKAP4与肌小节蛋白(MYH7、SAA、TPM1、TnT)结合在MUT中减弱；TEM示MUT中肌小节缩短、Z线至邻近ER距离增大、肌小节–ER接触位点/单位肌原纤维长度减少，证实肌小节错位削弱其与ER物理接触。
Overloading cholesterol in wild-type control iPSC-CMs phenocopies the pathological ER dysfunctions observed in DCM iPSC-CMs（WT对照iPSC-CMs中胆固醇超载模拟DCM iPSC-CMs所见病理性ER功能障碍）
水溶性胆固醇或甲羟戊酸内酯(mevalonolactone)处理WT iPSC-CMs升高质膜胆固醇并引起ER阳性面积缩减（cryo-ET见ER小管减少），且收缩持续时间缩短、达峰时间延长、搏动率下降、收缩幅度改变，模拟DCM表型，说明胆固醇异常足以驱动ER病损及收缩异常。
Pathological ER/cholesterol signaling is reversed by genetic or chemical rescue in DCM (MUT) iPSC-CMs（DCM MUT iPSC-CMs中病理性ER/胆固醇信号可被基因或化学手段挽救）
CRISPR修正TPM1-L185F突变使质膜胆固醇恢复正常、ER面积恢复。200 nM pitavastatin（HMG-CoA还原酶抑制剂）处理DCM iPSC-CMs降低胞内胆固醇、增加KDEL阳性ER面积（STED及cryo-ET确认ER网络恢复），并恢复CKAP4–ACTN2共定位（肌小节–ER接触修复）；250 nM squalene synthase抑制剂TAK475(lapaquistat)有相同效果。二者均显著改善DCM iPSC-CMs收缩幅度与动力学参数。
Cardiac tissues from DCM patients with end-stage heart failure recapitulate lipid imbalance and defective ER organization（终末期HF的DCM患者心脏组织重现脂质失衡与ER组织缺陷）
DCM-HF左心室组织脂类组学示胆固醇、鞘磷脂等升高，diacyl-PE降低。Sec61β免疫荧光示ER面积显著减小，ER连接点、分支、长度均低于供体对照。其中接受simvastatin治疗的DCM-HF8患者REEP5蛋白水平与供体无差异，提示降脂治疗可能部分保护ER架构。
DCM heart tissues exhibit dysregulation of ER structural and curvature-defining proteins（DCM心脏组织显示ER结构及曲率界定蛋白失调）
DCM-HF组织中REEP5总蛋白显著降低（与iPSC模型一致），LNP、ZFYVE27有变化但个体差异大；归一化至ER面积后REEP5无差异或升高。活体成人心房CMs胆固醇负载后ER阳性面积/细胞面积比下降，证实胆固醇调控ER组织在原生成人CMs中保守存在。
讨论与结论翻译
尽管治疗进步，DCM作为HF主要病因仍亟待新分子靶点。本研究利用人患者源iPSC-CM平台揭示：遗传性DCM突变致肌小节错位→肌小节与ER接触减少→ER失去结构支撑→ER架构严重紊乱（cryo-ET示膜曲率降低）→脂质特别是胆固醇稳态失衡→加重收缩功能障碍。ER曲率生成蛋白（如REEP5）总量减少系继发于ER萎缩。该新病理机制在终末期DCM患者左心室组织中被验证。CRISPR纠正突变或降胆固醇药（pitavastatin、squalene synthase抑制剂TAK475）可恢复ER架构、胆固醇信号及收缩功能。已有临床报道部分DCM患者用他汀获益，本研究为伴肌小节突变的DCM亚群提供了机制依据。综上，肌小节紊乱触发的ER/胆固醇信号缺陷是DCM的新疾病驱动通路，靶向此通路为DCM/HF治疗提供新策略；未来需在基因型明确的DCM患者亚群中进一步验证。
打赏
